Выделение лимфоцитов на фиколе

Для определения наличия и концентрации иммунокомпетентных клеток в донорской крови, использовался счетчик форменных элементов крови «Пикоскель ПС-4М». Данный счетчик используется в медицинской практике для счета форменных элементов крови: числа эритроцитов, лейкоцитов, и тромбоцитов.

Для «Пикоскеля ПС-4М» наиболее важными техническими характеристиками являются:

– определяемая концентрация форменных элементов крови от 2·103 до 105 см-3;

– определяемые размеры форменных элементов от 2 до 12 мкм;

– систематическая погрешность не более 15 %;

– случайная погрешность не более 4%;

– время измерения одной пробы не более 40 с.

Работа счётчика форменных элементов крови «Пикоскель ПС-4М» построена на принципе измерения импеданса и реализована на счёте электрических импульсов, вызванных исследуемыми частицами, проходящими через отверстие измерительной трубки. Исследуемые частицы помещаются с помощью дозирующих устройств в электропроводящую жидкость (электролит), который совместно с ними представляет собой вид суспензии.

При запуске цикла измерения в измерительной трубке возникает вакуум, под действием которого находящиеся в электролите частицы засасываются в измерительную трубку через отверстие. Когда уровень суспензии внутри измерительной трубки достигает первого внутреннего электрода, между ним и внешним электродом протекает постоянный по величине измерительный ток. Электрическое сопротивление между электродами значительно изменяется каждый раз, когда через отверстие измерительной трубки проходят частицы с электропроводимостью, отличающейся от электропроводимости электролита. Изменение сопротивления создает импульсы напряжения. Подключенный к электродам регистрирующий узел может определить концентрацию частиц. Когда внутри измерительной трубки уровень суспензии достигает второго внутреннего электрода, в измерительной трубке создаётся давление, под действием которого тот же самый объём суспензии из неё выталкивается и, находящиеся в нём частицы, снова проходят через измерительную трубку.

Подсчёт частиц всегда происходит в постоянном объёме измерительной трубки, ограниченном первым и вторым внутренними электродами. По окончании цикла измерения результаты счёта можно снять с дисплея счётчика или распечатать.

Для определения значения фона. Была установлена измерительная трубка, затем в измерительный стакан налили 10 мл чистого физиологического раствора с последующим добавлением трех капель гемолитика. Далее стакан с физиологическим раствором был установлен на столик. После был выбран режим для измерения лейкоцитов при измерительном токе 200 мкА. Значение фона составило 0,7·109 шт/л.

Для подсчета частиц крови одинаково пригодна кровь, взятая из вены в пробирку (цельная), а так же проба крови, взятая из кончика пальца (периферическая).

Для проведения данного опыта была использована цельная кровь, отобранная у здоровых и больных (ВПР ЧЛО) доноров.

Проведение измерения числа лейкоцитов производилось следующим образом. Измерительная трубка была установлена на 100 мкм, затем был выбран режим счета лейкоцитов WBC, с последующим выбором тока 200 мкА. Далее разбавляем кровь физиологическим раствором в пропорции 1:630 (16 мкл крови на 10 мл физиологического раствора) и добавляем три капли гемолизируюющего раствора (гемолитика). Спустя три минуты полученный раствор был установлен на измерительный столик и производим счет лейкоцитов.

Были определено, что в одном литре крови доноров содержится 4,6·109 штук лейкоцитов. Лимфоциты составляют 28% от общего числа лейкоцитов, следовательно, их концентрация 1,288·109шт/л.

Для выделения лимфоцитарной массы из цельной крови была использована методика [36]. Метод основан на разделении клеток крови при центрифугировании в градиенте плотности фиколла-урагрофина.

За сутки до выделения лимфоцитов из цельной крови, необходимо приготовить раствор фиколла-урографина с плотностью 1,093 г/мл. Раствор фиколла-урографина готовился следующим образом: в небольшом количестве дистиллированной теплой воды растворили 4,1 г фиколла 400, добавили 10 мл 76 % урографина и добавили дистиллят. Приготовленный раствор оставили на сутки. На следующий день довели водой до нужной плотности. Плотность раствора измеряли с помощью ареометра.

Для каждого исследуемого образца промаркировали по два эппендорфа вместимостью 1,5 мл – A и B. В пробирки, маркированные A, внесли с помощью дозатора по 500 мкл 0,9 % раствора NaCl стерильного, а затем таким же образом, поместили 500 мкл цельной крови и аккуратно смешали кровь с физраствором, тем самым стабилизировав кровь.

В эппендорфы, маркированные В, стерильных, внесли по 500 мкл фиколл-урографина. На фиколл-урографин аккуратно, избегая смешивания, наслаивали стабилизированную кровь, а затем, закрыв эппендорфы, поместили их в центрифугу Sigma 1-14 на 20 мин при скорости вращения равной 400 об/мин. По истечению 20 мин, содержимое эппендорфа представляло собой следующий гетерофазный раствор. На дно выпадал осадок красного цвета из эритроцитов и тромбоцитов, т. к. их плотность выше плотности фиколла-урографина. Надосадочная жидкость разделилась на две фазы: прозрачная – фиколл-урографин и красная жидкость, представляющая собой плазму крови. На границе раздела этих двух фаз образовалось кольцо из бело-желтых сгустков, содержащее лимфоциты. С помощью микродозатора производился сбор межфазного кольца, содержимое которого было помещено в отдельный стерильный эппендорф для дальнейшей отмывки клеток от примесей. Для отмывки клеток был добавлен физраствор в количестве 500 мкл, а затем эппендорфы снова были помещены в центрифугу на 10 мин со скоростью вращения 400 об/мин. После этого отбирали надосадочную жидкость. Выделенные лимфоциты цельной крови можно хранить при температуре минус 20 0С. На рисунке 2 представлена фотография выделенных лимфоцитов.

Фотография выделенных лимфоцитов, сделанная на оптическом микроскопе БИОМЕД-6 Вар 3 при увеличении 1

Рисунок 2 – Фотография выделенных лимфоцитов, сделанная на оптическом микроскопе БИОМЕД-6 Вар 3 при увеличении 1 : 1000

Источник

ВЫДЕЛЕНИЕ МОНОНУКЛЕАРОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

Выделение мононуклеаров периферической крови

1. Готовят градиент. В центрифужную пробирку (объем 10—15 мл) с пробкой вносят примерно 3 мл смеси метризоат — фиколл . Пробирку оставляют на столе до тех пор, пока градиент не примет комнатную температуру. (При 4°С работать не рекомендуется.)

2. Берут кровь. Переливают ее в коническую колбу, в которой находится дюжина стеклянных бус диаметром 2 мм. Колбу осторожно вращают кистью руки до тех пор, пока уже не будут слышны удары стеклянных бус друг о друга и о стенку колбы, т. е. пока кровь не свернется. (Не следует забывать об инфекционной опасности, которую представляет кровь человека.)

3. Разбавляют дефибринированную кровь равным объемом среды (PBS или BSS) при комнатной температуре.

4. С помощью пастеровской пипетки аккуратно наслаивают разбавленную дефибринированную кровь на градиент. Кончик пипетки загнут под углом 90° и отрезан алмазным ножом вблизи изгиба, чтобы избежать при наслаивании перемешивания градиента с кровью. (Можно поступить иначе. Вначале поместить дефибринированную кровь в чистую центрифужную пробирку, а затем подслоить под нее смесь метризоат — фиколл.)

5. Центрифугируют при 1500 g- в течение 15 мин., при комнатной температуре. (Во избежание перемешивания для остановки ротора центрифуги не следует пользоваться тормозом.)

6. Эритроциты и гранулоциты оседают на дно пробирки, а на границе раздела фаз находятся мононуклеарные клетки. Отсасывают прозрачный слой среды, расположенный непосредственно над опалесцирующим слоем мононуклеаров. Затем по всей площади сечения пробирки на границе раздела фаз собирают слой мононуклеаров. Клетки, прилипшие к стенкам, можно собрать кончиком пипетки. Мононуклеары переносят в чистую центрифужную пробирку.

7. Разбавляют взвесь мононуклеаров не менее чем четырехкратным избытком среды и тщательно перемешивают. С этого момента обработку клеток можно проводить при 4 °С. Чтобы сконцентрировать МПК, взвесь центрифугируют при 300 g в течение 10 мин.

Метризоат — фиколл,

изопак — фиколл,

гипак — фиколл

Например, для разделения клеток крови человека в градиенте плотности используют 9%-ный (вес/объем) раствор фиколла, чтобы приготовить градиент с плотностью 1,078 г/мл. Для разделения клеток крысы готовят 14%-ный (вес/ объем) раствор фиколла, чтобы окончательно градиент имел плотность 1,087 г/мл. Фиколл растворяют в дистиллированной воде при комнатной температуре и интенсивном перемешивании. К 24 объемам растворенного фиколла добавляют 10 объемов 32,8%-ного (вес/объем) раствора метризоата натрия

В качестве градиента плотности для разделения клеток крови можно использовать коммерческий препарат фиколл-400 (“Sigma-Aldrich” Швеция) или смесь фиколла с рентгеноконтрастными веществами с высокой плотностью (урографин, верографин, уротраст или изопак).

Фиколл – это фирменное название синтетического высокомолекулярного сополимера сахарозы и эпихлоргидрина. В иммунологических исследованиях используют 6,1%-или 9%-ные растворы фиколла с молекулярной массой 400 кДа (Фиколл 400). Для приготовления раствора фиколла его растворяют в теплой дистиллированной воде.

Приготовление градиента плотности фиколл-верографина

1. Подготовка фиколла: 4.32 (8.64) г порошка фиколл-400 растворяют в 48 (96) мл дистиллированной воды.

2. Подготовка раствора рентгеноконтрастного вещества (в частности, верографина): 10.14 (20.28) мл 76% раствора верографина доводят дистиллированной водой до 21 (42) мл.

3. Подготовка градиента плотности: растворы фиколл-400 и верографина смешивают. С помощью ареометра измеряют плотность полученного раствора, которая должна составлять 1.077 г/см. Если плотность выше, чем необходимо, то добавляют раствор фиколл-400, если ниже – раствор верографина. Градиент плотности можно хранить в течение 30 суток при температуре + 4˚С в склянке из оранжевого стекла.

При отсутствии фиколл-400 градиент плотности можно приготовить только из одного рентгено-контрастного вещества. С этой целью 10 (20) мл 76% раствора верографина смешать с 43.1 (86.2) мл дистиллированной воды и добавить 0.45 (0.9) мл. фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Полученный при этом 14.3% раствор верографина имеет плотность 1.077 г/см и может быть использован в качестве градиента плотности.

Следует отметить, что при применении метода седиментации в градиенте плотности для выделения лимфоцитов из общей суспензии форменных элементов крови необходимо использовать кровь доноров или животных, освобожденную от фибрина.

Трипановый синий

Готовят 0,2%-иый раствор красителя в PBS, содержащий 3 мМ NaN3, при продолжительном перемешивании. Перед использованием раствор центрифугируют для удаления агломератов красителя.

Натрий-фосфатный буфер. Phosphate buffered saline, PBS

Для приготовления 1 литра однократного натрий-фосфатного буфера используют:

8,00 г NaCl

0,20 г KCl

1,44 г Na2HPO4

0,24 г KH2PO4

растворяют в 800 мл дистиллированной воды доводят рН до 7,4 соляной кислотой или гидроксидом натрия добавляют дистиллированной воды до 1 литра.

PBS 1x

pH(1x)=7.3, (хранить при NT или при 4оС)

1x	100ml	500ml	1000ml
KH2PO4	136.1g/M	0.272g	2.72g
Na2HPO4x7H2O	268.1g/M	2.68g	26.8g
NaCl	58.44g/M	8.0g	80g
KCl	74.56g/M	0.20g	2.013g
H2O	mQ

*стерилизовать автоклавированием;

*pH зависит от концентрации, поэтому измерять лишь разбавив до 1х;

*pH 10x должен быть ~6.8 (если необходимо, можно довести NaOH). Стерилизовать автоклавированием. После разбавления pH должен стать 7.4.

Выделение мононуклеарной

фракции крови и костного мозга по методу Boyum

(Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow //Scand.J.Clin.Lab.Investig.-1968.-Vol.21-Suppl.97.p.1-9)

Принцип метода

Принцип метода основан на различии в плавучей плотности форменных элементов крови. Смесь полисахарида фиколла и рентгеноконтрастного вещества изопак или верографин создает градиент с такой плотностью, которая позволяет при центрифугировании разделить клетки периферической крови и костного мозга на мононуклеарную фракцию (МФ), в которую входят лимфоциты, субпопуляция моноцитов и бластные гемопоэтические клетки, и фракцию, содержащую гранулоциты и эритроциты. МФ обладают меньшей, чем градиент, плотностью и располагаются над градиентом. Плотность гранулоцитов и эритроцитов больше, чем плотность градиента, они проходят через градиент, опускаясь на дно пробирки.

Методика МФ выделяют из гепаринизированной крови или костного мозга (7-10 МЕ гепарина/мл для крови и 20 МЕ гепарина/мл для костного мозга).

Костный мозг разводят физиологическим раствором (рН 7,2) в соотношении 1:5; кровь, в соотношении 1:2 или 1:3.

Разведенную физиологическим раствором кровь или костный мозг центрифугируют в градиенте плотности фиколл-верографин (Pharma cia Fine Chemicals, Швеция), плотность 1,077 г/мл (Хейфиц Л.Б., Абалкин В.А.)

Разделение форменных элементов крови человека в градиенте плотности верографин-фиколл //Лаб.дело, 1973.-10.-с.579-581) при 400g в течение 30 мин.

Полученную МФ трижды отмывают в ЗФФР (физиологический раствор, забуференный с помощью фосфатно-солевого буфера) и ресуспендируют в среде RPMI-1640 (Flow Laboratories, Англия) в концентрации 106 клеток в мл.

Жизнеспособность клеток, определяемая по методу окрашивания с трипановым синим (Ланг Н.Р. Стимуляция лимфоцитов //М.:Медицина, 1976.-288 с.) превышает 96%.

Источник

Olgitta

Участник

25.04.2006 16:53

Помогите, пожалуйста! я – полный ламер :weep: , и никакого опыта работы с культурами не имею. Но вот “приспичило” проактивировать лимфоциты с ФГА трое суток. Цель- посмотреть изменение экспрессии по отношению к свежевыделенными. Сразу возникла куча вопросов. Помогите ответить!!!
Во-первых, очень бы хотелось просто иметь подробный протокол выращивания (если так можно выразиться, может, правильнее, поддержания) периферических лимфоцитов человека. Но уже сейчас у меня возникли конкретные вопросы:
1) Выделение. Мы выделяли их всегда на фиколе. Использовали Lymphocyte Separation Medium (ICN) и были довольны, выход хороший. По методике должны были иметь какой-то существенный процент моноцитов (все ж таки мононуклеарная фракция), но попытка прокрасить CD14 как-то очень мало их дала (может, пластик адгезивный был, а может, антитела хреновые – филатовские). Так что забивали. А теперь все-таки хочется от них избавляться. Может кто-нибудь посоветует, как правильно? Я имею в виду адгезию, нет у нас ни магнитных частиц, ни сортера.
2)Мы всегда разводили кровь и отмывали в растворе Хенкса (с кальцием и магнием). Для их последующего проживания в культуре это нормально?
3)Насколько актуально для культуры избавляться от остатков фикола и тромбоцитов? Если это важно, то как это сделать? Если можно, подробно, как надо крутить, чтобы лимфоциты сели, а тромбоциты нет? Что-то у меня они парой ходят 🙁
4) Можно растить только на RPMI? Другие среды не подходят? Сколько клеток на сколько среды? В каких дишах растить надо? Антибиотики принципиальны? какие? Что 5% СО2 обязательно, я вроде уже поняла…
5) Сколько ФГА надо? Принципиально, какой?
6) и еще, насколько кровь должна быть свежей? Не представляю, как можно меньше 3-4 часов ее мурыжить?
Заранее буду очень благодарна за все ответы!!!

Olgitta

Участник

26.04.2006 09:48

Спасибо вам, добрый человек!
Только я не поняла, сначала надо адгезию, а потом фикол, или наоборот или не важно? И по поводу отмывки: в какой среде лучше отмывать от тромбоцитов и фикола? Мне сказали, что отмывать надо просто холодным физраствором, никакие пбсы и хенксы не нужны и почему-то даже плохи. Почему так и почему холодным -тайна… Как надо по-вашему?
И не могли бы вы посмотреть точное число g для седиментации клеток без тромбоцитов?
А по поводу ФГА, именно его и надо по протоколу, чтобы стимульнуть, а вот интерлейкин не хотелось – во-первых, как дополнительное воздействие, во-вторых, просто нету. Мне казалось, что под ФГА трое суток они без ИЛ-2 проживут. Я не права?
И еще вопрос: сколько клеток надо сажать на какой объем среды или на площадь поверхности? Простите, если это очень глупо звучит, просто я вообще даже не биолог…
Буду очень благодарна за ответы.

semi

Постоянный участник
Москва

26.04.2006 10:40

Я изредка культивирую выделенные мононуклеары периферической крови для получения препаратов метафазных хромосом (чаще – просто цельную кровь). Задача – получить как можно больше метафаз через 48 часов культивирования. Кровь берется в пробирки с гепарином. Для выделения использую либо фиколл-урографин, либо спецслучаях – спецпробирки для выделения мононуклеаров с твердой фазой (https://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=362760 , недешевые). Выделять мононуклеары лучше в день взятия крови, если выделять на следующий день выше шанс получить вдобавок к мононуклеарам – эритроциты и полиморфонуклеарные клетки. Отмываю 1 раз холодным RPMI-1640, обогащенной 5% сывороткой с антибиотиками + гепарин 10 ед/мл. При отмывке крутить лучше при 4oC. Охлаждение помогает избавиться от слипания клеток, которое происходит время от времени, если использовать теплые растворы и центрифугу без охлаждения.
Для культивирования использую RPMI 1640 with Glutamax, 15% FBS, 2.5% PHA (M-form) Все реактивы – Gibco (Invitrogene). Конечная концентрация мононуклеаров варьировала в случаях с высоким митотическим индексом от 250 до 1650 на 1 микролитр,конечный объем культуральной среды – 6 мл. Мононуклеары культивирую в пластиковых 15 мл-центрифужных пробирках , лежащих почти горизонтально, в обычном термостате без СО2.
Про избавление от моноцитов сказать нечего – собственного опыта не имею.

Сообщение было отредактировано semi – 26.04.2006 15:06

Cells-nnm

moderator

26.04.2006 20:10

Только я не поняла, сначала надо адгезию, а потом фикол, или наоборот или не важно?

важно –
фикол, потом интерфазу отмыть 2-3 раза (последняя 1-2 отмывки это и есть plateletes depletion), и адгезия
если интерфаза содержит примесь эритроцитов – лизис, но после сбора пластик(-) фракции после адгезии

И по поводу отмывки: в какой среде лучше отмывать от тромбоцитов и фикола? Мне сказали, что отмывать надо просто холодным физраствором, никакие пбсы и хенксы не нужны и почему-то даже плохи. Почему так и почему холодным -тайна… Как надо по-вашему?

PBS
будете отмывать средой – разоритесь, если это 5-10 фальконов (50 мл.) и ежедневно…
я делаю всё при комнатной t – всё работает замечательно, по мне холод или RT – не принципиально, но если у вас в протоколе холод – делайте на +4
(в каждой лабе своя кухня)

. Мне казалось, что под ФГА трое суток они без ИЛ-2 проживут. Я не права?

фга без Ил-2 – 3 дня проживут, можно
больше – вряд-ли

сколько клеток надо сажать на какой объем среды или на площадь поверхности?

https://www.invitrogen.com/downloads/Useful…seful_Nmbrs.pdf

остальное – позже
да и почитайте все топики в форуме “методы” – там найдёте ответы на все вопросы – это уже обсуждалось много раз

Дядя ФАКСер

moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum

27.04.2006 00:43

(Olgitta @ 25.04.2006 14:53)

Для СD-14- сепарации – Милтенуевские бидзы (или Dynal) использовать надобно, коли чистую фракцию хотите.
Далее по пунктам
1) Хотите “убрать” моноциты? CD14 бидзы- и на ммагнитной колонке соберите негативную фракцию. Если нужны только Т-лимфоциты – пользуйтте pan-T MACS negative selection kit
2) Нормально – главное все делать быстро
3) Актуально. И это же просто делается: что мешает помыться 1-2 раза большим объемом?
4) RPMI-лучше всего. Сколько клеток- зависит от того, что вы хотите сделать 🙂 Антибиотики- принципа=иальны для первичной культуры (х.з. что там с донором было) – pen/strep обычно
5) А почему именно ФГА?
6) Хех: чем кровушка свежей- тем лучше.

Olgitta

Участник

27.04.2006 15:02

Большое спасибо всем
2 Cells-nnm:
В ссылке, которую Вы прислали, расписано для ХеЛа, а кто сказал, что для лимфоцитов – то же? У меня конкретный вопрос, на который те, кто этим занимается, с легкостью, я думаю, ответят (ну, а если не ответят, конечно литературу буду перелопачивать), потому и надеюсь на любезность грамотных людей. Так вот, вопрос:
сколько клеток на каком количестве / объеме среды надо растить???
Я ж их не так разведу, а они поди и исдохнут, жалко…
Посмотрела я по форуму то, что люди писали на эту тему, но ответа не нашла. Извините, если плохо искала.
И еще вопрос возник по ходу обсуждения:
А сколько времени и какими концентрациями ИЛ-2 надо обрабатывать лимфоциты а) более-менее чистые, б) популяцию с моноцитами/макрофагами, чтобы их активизировать? Задача – получить клетки в состоянии с максимальной синтетической активностью, я буду RT-PCR делать.

Cells-nnm

moderator

27.04.2006 17:03

У меня конкретный вопрос, на который те, кто этим занимается, с легкостью, я думаю, ответят (ну, а если не ответят, конечно литературу буду перелопачивать), потому и надеюсь на любезность грамотных людей. Так вот, вопрос:
сколько клеток на каком количестве / объеме среды надо растить???

в моих культурах стартовая плотность 1 млн/1 мл. – 1 well of 24-well plate, или 10-15 млн/10 мл – 25T flask
а потом смотрю как делятся и split

Дядя ФАКСер

moderator
Nothern Maccaronia, Ticinum

05.05.2006 00:50

(Cells-nnm @ 28.04.2006 04:25)

Проблема rpm-g заключается в том что когда ты приходишь в лабу, тебе дают готовый лаб. протокол выработанный годами до тебя и расчитанный на все лаб. дивайсы, а наша фуга в лабе уже лет 20 стоит и протоколу лет 10 как минимум, конечно там всё будет в rpm подсчитано для нашей фуги,
а искать формулы и пересчитывать в rpm моей фуги в g ради вас – меня ломает,
и инет же на это есть – там всё написано

для деплеции тромбоцитов: 400-450g = 900-1000 rpm 10′
простая отмывка – 450g – 5′
фиколл – 900g – 30′

концентрация IL-2 в культуре 50 U/ml

А ты что растишь? А Il-7? А IL-15?…

Guest
IP-штамп: frClxkmPIL4sQ

гость

18.02.2009 15:04

Добрые люди, подскажите, какую концентрацию надо брать пенициллин-стрептомицина + глутамина для культуры лимфоцитов (на мл). И еще, через 3 дня цвет среды может сильно меняться, или нет.

Спасибо заранее……

Annabel

Участник
Бостон, США

15.08.2013 19:57

(иван валерьевич @ 12.08.2013 08:23)

кто подскажет, технику выделения лимфоцитов из крови при помощи лимфолит – Н

Иван Валерьевич,
Протокол производителя работает хорошо (https://www.cedarlanelabs.com/Contents/Files?filePath=LABS%5CCL5010.PDF).
Я разбавляла PBS, а не medium (1:2), и наслаивала кровь на лимфолайт, а не поддувала лимфолайт под кровь, но это вопрос личных предпочтений…
Учтите, что в конце вы получите не только лимфоциты, но и моноциты. Гранулоцитов мало, если аккуратно собирать PMBC фракцию.

Удачи!

guest: SoLnCe
IP-штамп: frdjKPj8zXY9M

гость

12.11.2013 01:02

(Olia Brie @ 09.12.2010 20:21)

Скажите пожалуйста, можно ли для цитогенетики использовать не гепаринизированную кровь, а кровь в цитратном буфере? Или ещё такой вопрос..можно ли для ПЦР использовать кровь с гепарином? Знаю, что гепарин мешает проведению ПЦР. Проблема в том, что имея один образец крови, нужно и ПЦР поставить, и цитогенетику сделать. Какой антикоагулянт лучше выбрать?
Спасибо большое за советы. Только учусь культивировать лимфоциты 🙂

Olia Brie, подскажите, пожалуйста, каким образом вы культивируете лимфоциты. Весьма вас буду благодарна!:)

Источник