Выделение днк из лимфоцитов

Глава 29. Иммунологические методы

ВЫДЕЛЕНИЕ ПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ

Для проведения многих иммунологических исследований in vivo и in vitro требуются те или иные популяции лимфоцитов. Их получают от экспериментальных животных, в основном из тимуса, селезенки и периферических лимфоузлов. Некоторые специальные исследования требуют выделения клеток из других участков организма, например и з пейеровых бляшек. Рециркулирующие клетки можно получить путем канюлирования грудного лимфатического протока и сбора клеток в течение нескольких часов. У человека наиболее легко выделить лимфоциты периферической крови, а хирургическим путем можно получить также клетки селезенки, ми н дат и н и лимфоузлов. Однако хирургически отобранный материал часто содержит инфекционные агенты или опухолевые клетки, в зависимости от заболевания, которое вызвало необходимость хирургического вмешательства. Следует иметь в виду, что клеточные популяции, содержащиеся в перечисленных тканях, совершенно различны как но степени зрелости лимфоцитов, так и по численному соотношению в них клеток разных типов.

Тимус является источником довольно чистой Т-клеточной популяции, однако составляющие ее лимфоциты различаются по степени зрелости. При работе с лимфоцитами из других органов и тканей часто возникает необходимость в выделении отдельных субпопуляций для анализа их особых функций. Применение с этом целью описанного выше проточного флуоресцентного клеточного сортера, позволяющего разделять лимфоциты но их поверхностным маркерам, позволяет получать лишь ограниченное число клеток, поскольку скорость цитометрии с сортировкой весьма низка. Существует, однако, и ряд методов, позволяющих выделять лимфоциты и их отдельные субпопуляции сразу из всего объема исследуемого образца, – центрифугирование в градиенте плотности, розеткообразование, пэннинг и магнитное разделение.

Выделение в градиенте плотности основано на том, что лимфоциты имеют меньшую плотность, чем эритроциты и гранулоциты (рис. 29.19). Этот способ позволяет выделять большую часть лимфоцитов крови. Розеткообразование и пэннинг («просеивание» через подложку) используют для выделения субпопуляций (рис. 29.20 и 29.21). Пэннинг представляет собой разновидность аффинной хроматографии применительно к лимфоцитам. На сходном принципе основан и способ разделения с помощью магнитных гранул, покрытых специфическими антителами (например, анти-СD4). При смешивании с клетками гранулы связывают тс из них, которые распознаются фиксированными антителами. Эти клетки можно затем смыть с гранул или выделить путем наложения магнитного поля.

Рис. 29.19. Лимфоциты можно выделить из цельной крови в градиенте плотности фиколла. Для этого кровь дефибринируют путем встряхивания со стеклянными бусами и образовавшийся сгусток удаляют. Затем кровь разводят культуральной средой и наслаивают на раствор фиколла, заполняющий пробирку до половины. Плотность фиколла выше, чем плотность лимфоцитов, но ниже, чем плотность эритроцитов и гранулоцитов (например, нейтрофилов). После центрифугирования эритроциты и полиморфноядерные нейтрофилы (ПЯН), прошедшие через фиколл, образуют на дне пробирки осадок в виде пуговки, тогда как лимфоциты остаются на границе между средой, в которой они взвешены, и фиколлом. Препарат лимфоцитов освобождают затем от макрофагов и оставшихся ПЯН, добавляя в него железные опилки, они фагоцитируются, и поглотившие их фагоциты можно удалить при помощи сильного магнита. Макрофаги могут быть удалены и другим способом: клеточную суспензию помещают в пластиковую чашку; макрофаги прилипают к поверхности пластика и в суспензии остаются только лимфоциты.

Рис. 29.20. Метод розеткообразования основан на том, что лимфоциты некоторых субпопуляций несут рецепторы, связывающиеся с эритроцитами. Т-клетки человека имеют рецепторы для эритроцитов барана (Э) – молекулы CD2 (1). На Т-клетках мыши число таких рецепторов невелико, поэтому Т-лимфоциты мыши изолировать подобным способом невозможно. При смешивании Т-клетки вместе с эритроцитами образуют «розетки», которые могут быть отделены от неспособных к розеткообразованию В-клеток в градиенте плотности фиколла. Существует также модификация этого метода, позволяющая выделять клетки с другими рецепторами (2). Например. Тγ-лимфоциты (Т-клетки, несущие рецептор для Fc-фрагмента IgG, Fcγ) можно идентифицировать и выделить методом розеткообразования с эритроцитами быка, сенсибилизированными субагглютинирующим количеством антител к этим эритроцитам. На микрофотографии (3) виден лимфоцит, образовавший розетку с эритроцитами. (Фото любезно предоставлено д-ром Р. М. Lydyard).

Рис. 29.21. Клеточные популяции можно разделять на подложках, сенсибилизированных антителами. Нанесенные на подложку антитела нековалентно связываются с поверхностью пластика (как при иммуносорбентном анализе), после чего на нее наносят суспензию клеток. Антиген-положительные клетки (Аг+) связываются с антителами, тогда как антиген-отрицательные (Аг+) можно удалить осторожным смыванием. Связанные клетки иногда удается отделить от подложки, изменив условия культивирования или обработав клетки ферментами. Часто связывание клеток с иммобилизованным антигеном вызывает в них те или иные изменения; например, при связывании антигена с пластиком могут возникать перекрестные связи между его молекулами, в результате чего он активирует клетки. Данный метод наиболее подходит для удаления субпопуляций, а не для их выделения из общей популяции лимфоцитов. В качестве примеров применения данного метода можно назвать разделение популяций Тх- и Тц-клеток при помощи антител анти-СD4 или анти-CD8 и отделение Т-клеток от В-лимфоцитов с использованием антител анти-lg (которые связываются с поверхностными антителами В-клеток). При обратной постановке (сенсибилизация подложки антигеном) связывающие антиген клетки можно отделять от несвязывающих.

Другой способ — он применяется для удаления ненужной клеточной популяции, — основан на использовании антител и комплемента. Если к смеси клеток добавить специфические антитела (например, анти-CDS), а затем комплемент, клетки соответствующей субпопуляции будут лизированы. Конечно, для этого метода пригодны лишь такие антитела, которые связывают комплемент; кроме того, клетки-мишени должны нести на поверхности достаточное количество молекул антигена, чтобы фиксировать литическую дозу комплемента.

Источником определенных популяций лимфоцитов могут служить антигенспецифичные Т-клеточные линии, культивируемые в течение длительного периода (рис. 29.22). Получение таких линий позволяет обойтись без частого выделения первичных культур из органов и тканей животных.

Рис. 29.22. Одна из возможных процедур получения Т-клеточных линий. Мышей примируют антигеном, вводя его обычно под кожу на подошвенной стороне задней лапки. Через неделю у животных удаляют дренирующие эту область лимфоузлы (в данном случае подколенные и паховые), и полученные из них клетки культивируют в присутствии антигена на питающем подслое из сингенных (т. е. от мышей той же инбредной линии) клеток, например нормальных лимфоцитов или спленоцитов. Через 4 сут из культуры выделяют лимфобласты и индуцируют их пролиферацию с помощью ИЛ-2. Когда число клеток достаточно возрастет, проверяют их МНС- и антигенспецифичность в реакции трансформации лимфоцитов, Полученную линию культивируют попеременно на питающем подслое из клеток, стимулированных антигеном, и в ИЛ-2-содержащей среде.

Пандемия COVID-19 продолжается и усиливается. Все больше людей в мире встречается с данным вирусом. Уже давно стало понятно, что SARS-CoV-2 не исчезнет из человеческой популяции. Вероятность встречи с ним возрастает для каждого.

Тем не менее, многие люди, неоднократно и длительно контактировавшие с заболевшими COVID-19 – сами не заболевают, никаких клинических симптомов не появляется. Почему так происходит – один из самых насущных вопросов на всех уровнях попыток понимания текущей пандемии, от бытового до научно-медицинского.

Наиболее вероятный ответ на него – особенности иммунного ответа части населения. В предыдущих публикациях описывались варианты протекания инфекционного процесса при COVID-19, механизмы и сроки антителообразования В-лимфоцитами, с учетом того, что известно про эту инфекцию на данном этапе ее изучения. Однако, «не антителами едиными жив наш иммунитет…». В механизмах специфического иммунного ответа на патогены выделяют гуморальный иммунный ответ (опосредуемый присутствующими в плазме крови антителами) и клеточный иммунный ответ (опосредуемый клетками иммунной системы без участия антител). Клеточное звено иммунной системы (прежде всего, Т-клеточное звено) также играет немаловажную роль в появлении резистентности макроорганизма к той или иной инфекции. Как «вырисовывается» понимание – к COVID-19 тоже.

Т-клеточное звено состоит из различных пулов Т-лимфоцитов (обозначаемых общепринятой в иммунологии для указания их характерных маркеров аббревиатурой CD и цифрой/числом – CD-3, CD-4, CD-8, CD-16 и другие). Если ОЧЕНЬ упрощенно, то основные задачи Т-клеточного звена:

Опознать и изучить антиген – передать информацию о нем другим звеньям иммунной системы – уничтожить антиген – запомнить его.

У части людей, в силу особенностей иммунитета (а также, видимо, при инфицировании низкой дозой возбудителя), Т-клеточное звено элиминирует вирус из организма без значимой активации В-клеточного звена, то есть – с низким уровнем антителообразования, нередко не детектируемым (не определяемым) рутинными лабораторными методами. При этом, клинических симптомов часто не развивается. Иными словами, человек может перенести инфекционный процесс без развития болезни, уровень антител у него не определяется, но организм приобретает защиту от повторного заражения. Насколько стойкую и долгую – вопрос остается открытым.

Однако, недавние, достаточно объемные исследования группы ученых из нескольких стран выявили:

• Образование устойчивого Т-клеточного ответа на SARS-CoV-2 у большинства пациентов, встречавшихся с данным вирусом
• При этом у части пациентов, никогда не встречавшихся с SARS-CoV-2 – уже имеются Т-лимфоциты, реагирующие на данный вирус и элиминирующие его из организма.

До конца данный феномен пока не изучен, но наиболее вероятной является теория о том, что Т-лимфоциты у данных пациентов перекрестно активированы предыдущим воздействием широко циркулирующих в популяции «простудных» коронавирусов.

Подробнее –

здесь.

То есть: у части людей есть приобретенная невосприимчивость к SARS-CoV-2, обусловленная, вероятнее всего Т-клетками, которые ранее «активировались» другими коронавирусами и сохранили иммунологическую память.

Данное утверждение сложно проверить массовым лабораторным скринингом. Изучение Т-клеточного ответа к инфекциям – достаточно трудоемкий процесс и чаще удел специализированных научно-исследовательских лабораторий. Однако, уже опубликованные результаты и продолжающиеся работы по изучению Т-клеточного иммунитета при COVID-19 – дают определенную почву для осторожного оптимизма.

А.С. Поздняков, к.м.н.,
инфекционист, главный врач ООО «Инвитро-Сибирь»

Статистика INVITRO по пациентам с выявленными антителами к коронавирусу

Анализы для выявления антител в организме