Th1 и th2 лимфоциты

Иммунология — одна из самых «прикладных» и «практичных» биологических дисциплин, и эпидемия COVID-19 позволила лишний раз в этом убедиться. Одновременно это, пожалуй, один из самых сложных разделов науки о живом. В реализации иммунного ответа задействованы десятки разных типов клеток; сотни белков-лигандов: цитокинов, хемокинов; тысячи генов. Приложение методов системной биологии к решению иммунологических задач породило самостоятельную дисциплину — системную иммунологию. В третьей статье цикла «Пятерка по системной биологии» мы увидим, как методы системной биологии помогают разобраться в фундаментальных и прикладных аспектах Т-клеточного ответа.

Т-клеточный рецептор (TCR) — ключевая молекула адаптивного иммунного ответа

Иммунная система нашего организма состоит из двух «подсистем»: врожденного и приобретенного (адаптивного) иммунитетов. В основе этого деления лежит фундаментальное различие в молекулярных механизмах распознавания чужеродных молекул — антигенов — в этих двух подсистемах. Значимость изучения иммунной системы сложно переоценить: в 2011 году за это присудили Нобелевскую премию [1–3].

Клетки врожденного иммунитета (наиболее изученные из них — макрофаги) синтезируют множество различных рецепторов, распознающих «типичные» сигналы опасности — например, молекулу липополисахарида (LPS): важный компонент клеточной стенки бактерий. Счет таких рецепторов идет на десятки. Самая известная и хорошо изученная группа — это Toll-подобные рецепторы, но есть и другие. Число антигенов, которые могут распознать рецепторы врожденного иммунитета, может показаться небольшим, но все они проверены миллионами лет естественного отбора, так что в конечном счете врожденный иммунитет, несмотря на свою кажущуюся простоту, — весьма надежная защита. Во всяком случае, беспозвоночные животные, среди которых встречаются и крупные, и достаточно долгоживущие организмы, им обходятся.

Приобретенный (адаптивный) иммунитет устроен совсем иначе. Т-лимфоциты синтезируют лишь один тип рецепторов — Т-клеточные рецепторы (TCR). Однако если взять тысячу макрофагов, синтезирующих рецептор TLR4, то все эти рецепторы будут распознавать одну и ту же молекулу LPS. А если случайным образом выделить из пробы крови тысячу Т-клеток, то они будут распознавать тысячу разных антигенов. Подобное разнообразие достигается благодаря уникальным молекулярным механизмам, задействованным в созревании лимфоцитов: Т- и В-клеток. Подробнее обо всех этих хитросплетениях можно прочесть в статье «Иммунитет: борьба с чужими и… своими» [4].

Ген Т-клеточного рецептора на ранних стадиях созревания Т-лимфоцитов подвергается множеству перестроек и многократно мутирует в той области, которая кодирует часть рецептора, отвечающую за распознавание антигена. В разных клетках-предшественниках этот процесс идет независимо. Так что в результате зрелые Т-лимфоциты несут миллионы вариантов TCR. При этом каждая клетка синтезирует только один определенный вариант рецептора. Миллионы TCR способны распознавать миллионы антигенов — эта способность делает адаптивный иммунный ответ столь точным или, как предпочитают говорить ученые, «специфичным». Разнообразие Т-клеточных рецепторов в организме или в определенной популяции Т-лимфоцитов называется репертуаром TCR («Биомолекула» уже писала об этом [5]).

Чем богаче этот репертуар, тем больше чужеродных молекул способна распознать и обезвредить иммунная система данного человека. Изучение разнообразия Т-клеток и их рецепторов — одно из важнейших направлений современной иммунологии и интереснейшая задача с точки зрения системно-биологических подходов. Вот поэтому стипендия, которую аффилированные лица компании «Филип Моррис Интернэшнл» (ФМИ) в России вручают на базе Сколковского института науки и технологий, поддержала уже три проекта в этой области. Ну а нам особенно приятно отметить, что оба стипендиата, о которых будет рассказано далее, — не только замечательные молодые ученые, но и давние авторы и друзья «Биомолекулы».

Если у вас возник вопрос, что же такое «системная биология» и «системная иммунология», то почитайте нашу предыдущую статью из этого спецпроекта [6].

«Довольно сложно, на мой взгляд, выделить системную иммунологию во что-то отдельное от “просто иммунологии”, — говорит Иван Звягин, с.н.с. отдела геномики адаптивного иммунитета ИБХ РАН. — Методы in silico в настоящее время используются при решении практически любой задачи в иммунологии, да и в других биологических науках. Но для их разработки и совершенствования требуются “мокрые” эксперименты, в результате которых, собственно, и появляются те данные, которые системные биологи позже используют для проверки качества предсказаний. Сложно выделить “вычислительные” методы в самостоятельную науку, на мой взгляд».

Однако термин «системная иммунология» прижился, и ученые, которые заняты преимущественно теоретическими и вычислительными изысканиями в этой области, предпочитают использовать его, чтобы отличать себя от иммунологов-врачей и иммунологов-экспериментаторов.

«Близнецовый метод» в системной иммунологии

В формировании иммунитета, как и в любом сложном биологическом процессе, участвуют по меньшей меры две силы: наследственность человека, запечатленная в его генах, и факторы внешней среды, определяющие особенности индивидуального развития. Чтобы сравнить их относительный вклад, в биологии издавна используется близнецовый метод.

Однако репертуар Т-клеточных рецепторов на первый взгляд не кажется особенно подходящим объектом для изучения таким способом. Перестройка гена ТCR [11] происходит случайно не только в каждом организме, но в каждой отдельной клетке-предшественнице (рис. 1), так что, казалось бы, у близнецов не больше шансов иметь клетки с одинаковыми Т-клеточными рецепторами, чем у любых случайно взятых людей. Однако Михаил Погорелый, стипендиат 2016 года, решил проверить, а так ли это на самом деле?

Первая неожиданность: оказалось, что у близнецов больше клонов Т-лимфоцитов с одинаковым Т-клеточным рецептором! Как такое возможно в свете всего выше изложенного? Дело в том, что иммунная система начинает формироваться еще до рождения человека, хотя полностью «созревает» лишь через несколько лет после рождения. Однояйцевые близнецы делят одну плаценту на двоих, и похоже, что через нее они могут обмениваться иммунными клетками [12].

Дальше исследователи решили проверить, как организмы уже взрослых близнецов реагируют на введение чужеродного антигена.

«Мы использовали вакцину от желтой лихорадки как модель острой вирусной инфекции, — рассказывает Михаил Погорелый “Биомолекуле”. — Отсеквенировали репертуар TCR близнецов в нескольких временных точках, чтобы найти клоны Т-лимфоцитов, которые значимо возросли после вакцинации. Это сработало: нашли, что в каждом человеке около 1000 последовательностей β-цепи TCR проходят клональную экспансию, поскольку специфичны к эпитопам вируса желтой лихорадки».

Михаил продолжает: «Дальше посмотрели на сами эти последовательности. Выяснилось, что:

• совпадений аминокислотной последовательностей между людьми не очень много (из тысячи последовательностей, специфичных к желтой лихорадке, около 20 совпадает с близнецом и всего 1–3 с неродственным донором), то есть набор отвечающих клонов в каждом человеке почти уникальный. Но даже эти несколько совпадений — гораздо больше, чем можно ожидать, если бы клоны выбирались из каждого репертуара случайно. Это значит, что в разных людях для ответа на вакцину отбираются одинаковые последовательности TCR (и еще чаще в близнецах — скорее всего из-за того, что у них совпадают аллели MHC — их антигенпрезентирующие клетки показывают одни и те же антигены);
• внутри набора отвечающих TCR каждого донора много TCR-β-цепей со схожими последовательностями (1–2 а.к. замены). Это объясняется тем, что на один эпитоп одновременно отвечают сразу несколько TCR со схожими последовательностями [13]».

Из результатов этой работы родилась следующая идея. Поскольку в активном иммунном ответе принимает участие много схожих TCR одновременно, то можно создать алгоритм, который будет по единственному образцу репертуара находить TCR, вовлеченные в текущий иммунный ответ (они часто собраны в кластеры схожих последовательностей). Такой алгоритм был разработан и протестирован в лаборатории. И действительно, оказалось, что он позволяет выявлять клоны, отвечающие на вакцинацию, по единственному анализу репертуара (скажем, через три недели после вакцинации). Это, разумеется, куда дешевле и проще, чем делать множество измерений в разных временных точках с той же целью [14].

Проект Михаила — наглядный пример того, как в рамках одного исследования «классическая иммунология», то есть секвенирование рецепторов близнецов, эволюционирует в «системную иммунологию» — разработку алгоритма для поиска кластеров Т-клеток, вовлеченных в текущий иммунный ответ. Именно такой логике следует общее развитие системной иммунологии в наши дни.

Эти многоликие Т-лимфоциты

Человеку, знакомому с разнообразием клеток врожденного иммунитета (макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы, эозинофилы и так далее), система приобретенного иммунитета может показаться даже примитивной, ведь в ней, казалось бы, всего два типа клеток: Т-лимфоциты и В-лимфоциты. Однако это впечатление ошибочно. Во-первых, Т-клетки делятся на две большие группы: «киллеры» (CD8+) и «хелперы» (CD4+). А во-вторых, даже внутри этих групп, особенно среди Т-хелперов, также наблюдается большое разнообразие. Разные группы Т-хелперов — Th1, Th2, Treg, Th9, Th22 — синтезируют различные типы цитокинов и тем самым обеспечивают разнообразие и гибкость иммунного ответа. Все эти Т-лимфоциты экспрессируют на своей поверхности TCR. Естественным образом возникает вопрос: а насколько одинаковы или, напротив, различны репертуары Т-клеточных рецепторов в разных Т-клеточных популяциях? Поискам ответа на него посвящен проект Софьи Касацкой, стипендиата 2019 года.

При этом нужно учесть, что различные типы Т-хелперов при определенных условиях способны превращаться («перепрограммироваться») друг в друга (рис. 3). Механизмы и пути таких перевоплощений изучены пока недостаточно. Но анализ репертуаров ТСR может пролить свет на запутанные отношения между различными популяциями Т-лимфоцитов. Совпадение репертуаров рецепторов в двух разных популяциях клеток-хелперов дает основания полагать, что эти группы клеток имеют общее происхождение и, вероятно, способны превращаться друг в друга. И, напротив, различия в репертуарах ТСR будет знаком того, что данные популяции лимфоцитов формируются независимо.

Софье удалось показать, что репертуары TCR в популяциях Th17- и Th22-лимфоцитов, играющих важную роль в регуляции аутоиммунных реакций, частично совпадают с репертуаром Th2-клеток, что указывает на тесную связь между этими тремя популяциями. При этом клетки типа Th1-17, обладающие, как это следует из названия, свойствами как Th1, так и Th17-лимфоцитов, имеют общие TCR только с Th1-клетками, но не с Th17. Это позволяет с уверенностью говорить об их происхождении от Th1-лимфоцитов [17]. Так, изучение разнообразия Т-клеточных рецепторов позволяет пролить свет на механизмы пластичности Т-лимфоцитов, понимание которых очень важно, например, при разработке новых видов иммунотерапии.

Особое внимание в проекте уделяется регуляторным Т-клеткам (Treg). Эта популяция Т-лимфоцитов имеет особый путь развития. Их задача в организме — удерживать иммунный ответ в безопасных для организма рамках. Нарушение в активности этих клеток может привести к развитию аутоиммунных заболеваний. Чтобы изучить процесс формирования этой стороны иммунитета, исследователи планируют сравнить TCR-репертуар регуляторных клеток у новорожденных с незрелой иммунной системой, контактировавшей лишь с небольшим числом чужеродных агентов, и у взрослых людей.

Первая статья с результатами по этому проекту уже отправлена в журнал, так что пожелаем Софье скорой и успешной публикации.

Широкие горизонты системной иммунологии

Так получилось, что оба упомянутых в статье стипендиата работают над задачами, связанными с репертуаром Т-клеточных рецепторов. Но это далеко не единственная область иммунологии, где применяются методы системной биологии. Одни ученые собирают и упорядочивают информацию о сигнальных путях иммунных клеток — чтобы использовать ее при анализе разнообразных омиксных данных. Другие строят математические модели, описывающие поведение лимфоцитов. Третьи используют технологии «распознавания образов» (image recognition) для того, чтобы углубить наше знание о взаимодействии иммунных клеток. И это далеко не полный перечень тем и подходов, которые используют иммунологи сегодня. Своими соображениями о будущем системной иммунологии и самых интересных задачах, стоящих перед этой наукой, с нами поделился старший научный сотрудник ИБХ РАН Иван Звягин (рис. 4):

«В современной иммунологии есть интереснейшие направления, где алгоритмы анализа больших “иммунологических” и вообще “биологических” данных играют главенствующую роль, так как на их основе можно создавать инструменты, предсказывающие те или иные иммунологические явления и позволяющие манипулировать иммунным ответом в нужном направлении.

В частности, на данный момент мы плохо понимаем, каким образом в каждом конкретном случае происходит связывание Т-клеточного рецептора с комплексом пептид—МНС (pMHC, peptide-loaded major histocompatibility complex), которое приводит к активации Т-лимфоцитов.

Если мы научимся предсказывать силу связывания TCR с тем или иным pMHC на основе их аминокислотных последовательностей, это позволит понять, чем определяется иммуногенность того или иного антигена. В сочетании со знаниями о закономерностях формирования репертуара распознающих рецепторов, это даст возможность разработать алгоритмы для предсказания оптимальных эпитопов для выработки нужного иммунного ответа против новых инфекций или терапии опухолей, оценки риска распознавания “своего” и рационального дизайна узнающей части рецепторов при совершенствовании способов клеточной терапии (например CAR-T-терапия [19]).

С другой стороны, те же алгоритмы будут задействованы и в направлении создания неиммуногенных вариантов белковых последовательностей, когда это важно — например при генотерапии.

Ответы на все эти вопросы — дело ближайшего будущего. Полученные данные и созданные алгоритмы в дальнейшем позволят разрабатывать способы рационального дизайна иммунной системы, исходя из особенностей конкретного человека, с целью снижения риска развития заболеваний и увеличения продолжительности активной жизни».

Заключение

Иммунные клетки, как было рассказано выше, проходят сложные пути дифференциации и развития, которые мы пока понимаем лишь отчасти. Чтобы разобраться в фундаментальных механизмах, определяющих разнообразие клеточных популяций в человеческом теле (около 200 типов!), мы должны опуститься еще глубже — с клеточного на молекулярный уровень — и попытаться понять, каким образом организация хроматина в ядрах клеток определяет их способность участвовать в тех или иных сигнальных путях. Этой интереснейшей теме будет посвящена следующая статья нашего цикла.

1. Толл-подобные рецепторы: от революционной идеи Чарльза Джейнуэя до Нобелевской премии 2011 года;
2. Иммунологическая Нобелевская премия (2011);
3. Интервью с профессором Йельского университета Русланом Меджитовым;
4. Иммунитет: борьба с чужими и… своими;
5. Анализ индивидуальных репертуаров Т-клеточных рецепторов;
6. Клеточная, молекулярная и системная биология: как биологи и биоинформатики вместе рисуют общую картину жизни;
7. Feifei Qiu, Chun-Ling Liang, Huazhen Liu, Yu-Qun Zeng, Shaozhen Hou, et. al.. (2017). Impacts of cigarette smoking on immune responsiveness: Up and down or upside down?. Oncotarget. 8, 268-284;
8. Won-Kyung Cho, Chun Geun Lee, Lark Kyun Kim. (2019). COPD as a Disease of Immunosenescence. Yonsei Med J. 60, 407;
9. Gaetano Caramori, Paolo Casolari, Adam Barczyk, Andrew L. Durham, Antonino Di Stefano, Ian Adcock. (2016). COPD immunopathology. Semin Immunopathol. 38, 497-515;
10. Мир до и после изобретения вакцин;
11. Daniel J Woodsworth, Mauro Castellarin, Robert A Holt. (2013). Sequence analysis of T-cell repertoires in health and disease. Genome Medicine. 5, 98;
12. Mikhail V. Pogorelyy, Yuval Elhanati, Quentin Marcou, Anastasiia L. Sycheva, Ekaterina A. Komech, et. al.. (2017). Persisting fetal clonotypes influence the structure and overlap of adult human T cell receptor repertoires. PLoS Comput Biol. 13, e1005572;
13. Mikhail V. Pogorelyy, Anastasia A. Minervina, Maximilian Puelma Touzel, Anastasiia L. Sycheva, Ekaterina A. Komech, et. al.. (2018). Precise tracking of vaccine-responding T cell clones reveals convergent and personalized response in identical twins. Proc Natl Acad Sci USA. 115, 12704-12709;
14. Mikhail V. Pogorelyy, Anastasia A. Minervina, Mikhail Shugay, Dmitriy M. Chudakov, Yuri B. Lebedev, et. al.. (2019). Detecting T cell receptors involved in immune responses from single repertoire snapshots. PLoS Biol. 17, e3000314;
15. Minervina A.A., Komech E.A., Titov A., Koraichi M.B., Rosati E.