Реакция бласттрансформации лимфоцитов при туберкулезе
Комплексная туберкулинодиагностика. Реакция лейкоцитов на введение туберкулина.Совместно с Р. А. Иоффе мы в 1959 г. разработали вариант комплексной методики туберкулинодиагностики, который позволяет учесть одновременно очаговую и общую реакцию в виде изменения состава белковых фракций сыворотки крови. У части больных активным туберкулезом через 48 ч после введения 5—20 ТЕ уменьшается уровень альбуминов и увеличивается содержание глобулинов. При этом возможна диссоциация в результатах определения туберкулиновой чувствительности различными способами. Так, у больных с выраженной кожной аллергией белковые фракции сыворотки крови могут не изменяться. Возможно и обратное соотношение. Чаще совпадают общие, очаговые реакции и биохимические сдвиги. Важно, что сдвиги в белковых фракциях крайне редко наступают при неактивных туберкулезных изменениях, неспецифических заболеваниях легких. Достоверность этой пробы, выпадающей положительной, правда, только у части больных активным туберкулезом, была подтверждена многими исследователями, применившими ее у взрослых и детей при дифференциальной диагностике различных заболеваний органов дыхания, а также при определении активности туберкулеза. Последующие исследования, проведенные нами совместно с М. Н. Доброхотовой, Р. А. Иоффе и М. 3. Упитером (1967), показали, что при клинической и рентгенологической активности процесса, помимо снижения уровня альбуминов и повышения содержания в сыворотке крови альфа-глобулинов, наступает уменьшение концентрации гликопротеидов в альбуминовой фракции и увеличение их в альфа-глобулиновой фракции. Такие сдвиги отмечались лишь у части больных активным туберкулезом, но они, как правило, отсутствовали при неактивном и излеченном процессе. Между тем при активном туберкулезе после подкожного введения туберкулина не изменяются существенно уровень липопротеидов, содержание сиаловой кислоты, не появляется С-реактивный белок. Однако указанными тестами не исчерпываются все возможности определения иммунобиологического состояния организма инфицированного или больного туберкулезом человека. В этой области велись и проводятся поиски других способов исследования. Уже давно пытались изучить влияние in vitro туберкулина на клетки периферической крови, селезенки, лимфатических узлов больных, а также инфицированных или здоровых людей и животных (Rich, Lewis, 1932, и др.). При этом было установлено, что в одних случаях происходит разрушение сенсибилизированных клеток, а в других, наоборот, — их бласттрансформация. Этот феномен связан отчасти с повреждением клеток организма в результате их взаимодействия с антигеном, а также с возможностью пассивного переноса аллергии лейкоцитами крови.
Это обстоятельство побудило нас в 1941 г. изучить в тканевых культурах изменение лейкоцитов крови больных или инфицированных туберкулезом для выявления специфической сенсибилизации организма. При этом мы могли установить, что вскоре после помещения лейкоцитов во флаконы наступает интенсивная миграция главным образом зернистых лейкоцитов. Через 48 ч наряду с зернистыми лейкоцитами, лимфоцитами и моноцитами появляются макрофаги или полибласты Максимова, а иногда и вытянутые фибробластоподобные клетки. Через 3—4 дня зернистые лейкоциты дегенерируют, а количество макрофагов и фибробластоподобных клеток увеличивается. К 5—6-му дню образуются гигантские клетки. После добавления в культуру лейкоцитов микобактерий туберкулеза ускоряется бласттрансформация лейкоцитов больных с благоприятно протекающими формами легочного туберкулеза. Уже через 24—48 ч в таких случаях, помимо лимфоцитов и моноцитов, можно обнаружить макрофаги, фибробластоподобные и гигантские клетки, которые скопляются вокруг микобактерий, частично подвергающихся фагоцитозу. В дальнейшем образуется синцитиальная ткань, распадающаяся спустя 10—14 дней после начала опыта. При массивной дозе микобактерий туберкулеза происходит замедленное превращение клеточных элементов, которые в дальнейшем быстро разрушаются. У больных с распространенными и неблагоприятно протекающими формами туберкулеза гигантские клетки образуются лишь к 5—6-му дню, а часто уже на 3—4-й День происходит распад клеточных элементов. Подобные результаты мы получали и в опытах с культурами лейкоцитов в присутствии туберкулина. Установлено, что туберкулин даже в большой концентрации не влияет на развитие лейкоцитов у лиц, не зараженных туберкулезом или клинически здоровых. Но в тех же дозах он вызывает быстрый распад лейкоцитов у больных туберкулезом, в особенности при тяжелых его формах. Таким образом, изучение клеточных реакций убедило нас в их определенной зависимости от уровня специфической сенсибилизации и реактивности организма. К такому выводу в дальнейшем пришли и другие авторы, пользовавшиеся тем же или разработанными на том же принципе способами исследования. Установлено, например, что микобактерий туберкулеза интенсивно размножаются внутри лейкоцитов здоровых или зараженных вирулентными микобактериями животных. Между тем в тканевых культурах лейкоцитов животных, предварительно вакцинированных БЦЖ, микобактерий не развиваются или размножаются слабо. Выяснилось также, что лейкоциты здоровых животных длительно сохраняются в нормальной плазме в присутствии туберкулина. Между тем лейкоциты туберкулезных животных в тех же условиях разрушаются в течение одного часа. Hall, Scherago (1957) при изучении культуры лейкоцитов от 297 больных туберкулезом и 212 здоровых людей также выявили более высокую сенсибилизацию к туберкулину лейкоцитов больных туберкулезом и здоровых, но инфицированных людей по сравнению с отрицательно реагировавшими на пробу Манту. В сущности тот же принцип лежит в основе метода, позволяющего определить степень повреждаемости нейтрофилов в присутствии очищенного сухого туберкулина. Если этот показатель (ППН) составляет в норме 0,06—0,09, то при активном туберкулезе он выше в 1,5—3,5 раза. Для выявления повышенной чувствительности организма и активности туберкулезного процесса исследуют также реакцию торможения миграции лейкоцитов и бласттрансформации лимфоцитов периферической крови in vitro под влиянием туберкулина. Оказывается, что у больных эволютивным и деструктивным туберкулезом замедляется миграция и угнетается иммуноспецифическая бласттрансформация клеточных элементов. Этот феномен не отмечается у здоровых людей. Еще более отчетливо выявляется тот же характер клеточных реакций после подкожного введения туберкулина (20ТЕ). Как показали исследования, проведенные в нашей клинике А. С. Борзенко (1974) на 130 детях и подростках, через 48 ч после впрыскивания туберкулина при активном туберкулезе усиливается торможение миграции лейкоцитов и угнетается бласттрансформация лимфоцитов. Одновременно повышается уровень щелочной фосфатазы нейтрофилов. Эти сдвиги в значительно меньшей степени выражены при излеченном туберкулезе, у инфицированных, но здоровых детей, а также при хронической пневмонии. По данным автора, эти пробы оказались более чувствительны по сравнению с другими методами туберкулинодиагностики. Тем не менее их диагностическое значение увеличивается при одновременном использовании других туберкулиновых проб, вызывающих, в частности, очаговые реакции, и, конечно, в сочетании с результатами клинико-рентгенологических методов исследования. – Также рекомендуем “Лабораторная диагностика туберкулеза. Выявление бактерий туберкулеза.” Оглавление темы “Туберкулинодиагностика.”: |
Источник
Для оценки иммунной системы изучают характеристику функционального состояния иммунокомпетентных клеток и интенсивности специфического ответа их на аллерген (туберкулин). Главной задачей иммунологических исследований при туберкулезе является выявление возможных сдвигов в том или ином звене иммунной системы, которые могут быть обусловлены закономерной реакцией на антиген или быть проявлением иммунодефицита (см. табл.). Для оценки состояния иммунокомпетентных клеток проводятся исследования, которые характеризуют их количество и функцию. С этой целью используется большой набор иммунологических методик, которые позволяют оценить системные и местные защитные механизмы.
- Изменения в иммунной системе при туберкулезе
- Гиперергические реакции
- Определение уровня специфических антител
- Выявление туберкулезных антигенов
Методы иммунологических исследований при туберкулезе (Чернушенко К.Ф., 2003)
КРОВЬ | |
Т-лимфоциты | |
• | Количество Т-ЛФ |
• | Субпопуляционный состав |
• | Реакция на митогены и аллергены |
В-лимфоциты | |
• | Количество В-ЛФ |
• | Реакция на митогены |
• | Уровень 1 β ( А, 0, М, Е ) |
• | Содержание антител (природных, |
специфических, аутоантител) | |
• | Уровень ЦІК |
Фагоцитирующие клетки ( НГ, Мц ) | |
• | Количество |
• | Адгезия, миграция, хемотаксис |
• | Поглощающая активность (неспецифічні |
и специфические тест-объекты | |
• | Переваривательная способность |
• | НСТ НГ, Мц |
• | Активность клеточных ферментов |
У большинства больных туберкулезом имеющиеся изменения в иммунной системе, сказываются:
- снижением числа Т-лимфоцитов и их пролиферативной способности;
- изменением соотношения субпопуляционных клеток (хелперов, киллеров);
- дисфункцией В-клеточного звена (увеличением или уменьшением содержания В-клеток, дисиммуноглобулинемия, снижением содержания естественных антител);
- изменением функционального состояния фагоцитирующих клеток (снижением или усилением их поглощающей способности, адгезии, миграции, активности клеточных ферментов), активацией специфических клеточных и гуморальных реакций (табл.).
Изменения в иммунной системе при туберкулезе
Основные изменения в иммунной системе при туберкулезе (Чернушенко К. Ф., 2003)
НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ | СПЕЦИФИЧЕСКИЕ | |
Т-лф | снижение числа Т-ЛФ | • увеличение числа сенсибилизированных Т-ЛФ |
В-лф | • изменение (чаще увеличение) числа В-ЛФ | • увеличение уровня специфических антител и ИК |
Микобактерия туберкулеза
Выраженность и направленность указанных изменений неоднозначны при различных формах и фазах туберкулезного процесса, зависят от степени интоксикации, длительности заболевания, наличия деструктивных изменений, массивности бактериовыделения.
Заключение о состоянии иммунокомпетентных клеток (ИКК) должно быть индивидуальным, учитывающим особенности клинической симптоматики. Иммунодиагностика больных туберкулезом включает не только оценку ИКК, циркулирующих в крови, но и местных реакций. Для этого проводится исследование бронхоальвеолярного смыва (БАЗ) или плеврального экссудата. Для характеристики местного иммунитета применяют комплекс клеточных и гуморальных реакций: определение количества клеток, их структуры, жизнеспособности, функциональной активности альвеолярных макрофагов (АМФ) и нейтрофилоцитов (Нф), содержания гуморальных факторов.
При туберкулезе количество клеток в БАЗ обычно не отличается от нормы, их жизнеспособность снижается умеренно, но значительно изменяется клеточный состав БАЗ за счет уменьшения содержания АМФ и лимфоцитов и увеличение содержания Нф. Изменяется функциональная активность фагоцитирующих клеток: снижаются их миграционная, адгезивная и поглощающая способности, но кислородзависимый метаболизм и активность клеточных ферментов усиливаются. Эти показатели зависят от тяжести патологического процесса в легких.
Исследование гуморальных факторов: β1-3, лизоцима, антител достаточно сложное. Это связано с неодинаковым объемом и насыщенностью смыва, что является причиной значительного расхождения показателей у отдельных больных. Поэтому Чернушенко К.Ф. был применен расчет показателей с учетом содержания белка в БАЗ. Содержание и лизоцима у больных туберкулезом значительно ниже, чем у здоровых лиц, и зависит от состояния слизистой оболочки бронхиального дерева (атрофии, гиперплазии и т.д.), наличии признаков хронического бронхита.
Проведение исследования состояния местного иммунитета возможно не у всех больных, так как промывание глубоких отделов легких опасно при наличии деструкции в легких. Поэтому проводилось сравнение аналогичных показателей состояния фагоцитирующих клеток (альвеолярных макрофагов — АМФ и нейтрофилов — Нф) БАЗ и моноцитов (Мц) и Нф периферической крови. Параллелизма указанных показателей выявлено не было, наоборот, изменения клеток БАЗ были интенсивными, чем клеток крови. Не отмечено параллелизма и в уровнях 8Іβ и сывороточного Іβ, лизоцима в крови и БАЗ. Расхождение этих показателей в крови и БАЗ свидетельствует об определенной автономности местных защитных механизмов и необходимости их оценки при патологии легких, в том числе при туберкулезе.
Значение специфической клеточной ПЧСТ (повышенная чувствительность замедленного типа), развивающейся в организме в ответ на проникновение МБТ, заключается в том, что она является классическим примером иммунодиагностики. Проба Манту как отражение ПЧСТ используется при определении показаний к ревакцинации БЦЖ, которая проводится только туберкулинонегативным детям. Используется проба и для дифференцирования поствакцинального и инфекционного иммунитета (обусловлен инфицированием вирулентными МБТ), что имеет значение для определения потребности в химиопрофилактике. Определение интенсивности туберкулиновой реакции имеет значение для проведения дифференциальной диагностики заболеваний различных органов туберкулезной и нетуберкулезной этиологии. При этом учитывают характер и интенсивность реакции.
Гиперергические реакции
В практическом плане очень сложными являются вопросы диагностического значения гиперергических реакций при отсутствии клинических признаков туберкулезного процесса и негативных результатов — при наличии туберкулеза. Поскольку туберкулиновая аллергия является проявлением противотуберкулезного иммунитета, практическое значение имеет вопрос о сущности гиперергических реакций, или отображают они высокую устойчивость против МБТ. По мнению К. Ф. Чернушенко, туберкулиновая гиперергия свидетельствует о наличии длительного антигенного стимула и о возможности организма ответить бурной реакцией на аллерген-туберкулин, а также на повторное введение даже незначительных доз МБТ. Это объясняет высокую заболеваемость туберкулезом лиц с гиперергическими туберкулиновыми реакциями и оправдывает отнесение их к группе риска. В то же время ориентация только на туберкулиновые пробы может осложнить дифференциальную диагностику заболеваний со схожей клинической симптоматикой.
Гиперергические реакции могут быть обусловлены не только наличием сенсибилизации к МБТ, но и повышенной чувствительностью к другим инфекционным и неинфекционным аллергенам. Это объясняется феноменом параалергии, механизм которого обусловлен наличием подобных антигенных детерминант, а также пролиферацией клонов лимфоцитов, преадаптованных ко многим аллергенам. Явление параалергии имеет особое практическое значение при дифференциации поствакцинальных аллергии и виража у детей с наличием хронических тонзиллитов, часто болеющих ОРВИ. Таким пациентам иногда назначается химиопрофилактическое применение противотуберкулезных препаратов.
В ряде случаев возникают диагностические проблемы у больных туберкулезом с негативными реакциями на туберкулин. Многие авторы считают, что это – результат ареактивности вследствие тяжести патологического процесса. Существует ряд факторов, объясняющих отрицательный ответ на туберкулин: нарушение клеточного взаимодействия регуляторных клеток вследствие высокого уровня антигенов, активация супрессорного действия макрофагов и др. Уменьшение антигенной нагрузки при антибактериальной терапии ведет к появлению положительных туберкулиновых реакций. Наличие как анергии, так и гиперергии у лиц с легочной патологией требует серьезного их обследование, которое включает не только определение интенсивности кожных туберкулиновых реакций, но и применение иммунологических тестов, особенно регуляторных — хелперов, супрессоров.
Сейчас разработаны и применяются пробы, характеризующие реакцию организма на туберкулин: реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ), реакция торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ), реакция торможения адгезии лейкоцитов (РГАЛИ), которые выявляют наличие и степень чувствительности к туберкулину. Эти тесты целесообразно проводить с различными дозами туберкулина, что позволяет выявить характер чувствительности (адекватный, парадоксальный, уравнительный), что имеет значение при решении вопроса о скрытой активность туберкулезного процесса.
Определение уровня специфических антител
Диагностическое значение имеет и определение интенсивности другого феномена противотуберкулезного иммунитета — уровня специфических антител, большой спектр которых (преципитинов, агглютинины, лизины и др.) Обусловлен особенностями антигенного состава МБТ. Для их выявления предложены различные серологические реакции (преципитации, гемагглютинации, гемолиза, связывания комплемента, иммуноферментный анализ.).
Несмотря на почти вековую историю использования серологических реакций при туберкулезе, до сих пор не определена роль специфических антител в механизме противотуберкулезного иммунитета. Четко установлено, что они не имеют самостоятельного протективного эффекта: сыворотки крови, содержащие антитела, не подавляют рост МБТ. В то же время доказано, что антитела усиливают активность фагоцитирующих клеток. Следовательно, преимущественно клеточный характер противотуберкулезного иммунитета дополняется включением на определенном этапе гуморального звена объясняется кооперативной взаимодействием Т, В-лимфоцитов и фагоцитирующих клеток.
Несмотря на значительные антигенные свойства МБТ, титр противотуберкулезных антител у больных туберкулезом достаточно низкий (1: 8 – 1:64). Изучена зависимость между частотой их выявления и содержания и продолжительностью заболевания туберкулезом. Антитела обнаруживаются довольно часто (95-98%) у больных с хроническими деструктивными процессами и значительно реже (35-50%) у пациентов с “малыми” формами туберкулеза.
В последнее время предложены методы выявления противотуберкулезных антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Но пока еще не существует достаточно убедительных серологических методик, которые можно использовать для дифференциальной диагностики и определения степени активности туберкулезных изменений. Однако высокий титр антител (1:32 – 64) рассматривается как основание для целенаправленного обследования пациента.
Кожные и клеточные реакции на туберкулин и специфическое антителообразование при туберкулезе часто развиваются не параллельно. Умеренные и даже слабые реакции на туберкулин могут сопровождаться высокими титрами противотуберкулезных антител. Такое состояние иммунной системы является неблагоприятным и может быть «предвестником» прогрессирования туберкулезной инфекции. Антитела также участвуют в образовании иммунных комплексов, высокий уровень которых может вызвать нарушение трофики тканей вплоть до их деструкции.
Выявление туберкулезных антигенов
Иммунодиагностика туберкулеза включает определение не только титра антител, но и выявление туберкулезных антигенов. Эта задача достаточно сложная в силу сходства антигенов патогенных МБТ к антигенам микобактерий-сапрофитов, нокардий, листерий и коринебактерий. С этой целью используются различные методы электрофореза, основанные на физико-химическом фракционировании. Затрудняет обнаружение антигенов их локализация в иммунных комплексах. Для выявления антигенов используют и моноклональные антитела, но для практических целей эти методы еще не применяются.
Специфические иммунологические методы могут быть применены и для типирования МБТ, выделяемых больными туберкулезом. Для этого используют молекулярно-генетические методы, которые основаны на различиях ДНК различных видов МБТ, оказываются в патологических материалах (полимеразная цепная реакция, ДНК-зонды). В последние годы применяются моноклональные видоспецифические антитела к антигенам микобактерий. Однако все эти методы идентификации микобактерий и выявления антигенов достаточно трудоемки и используются главным образом в научных целях.
При туберкулезе регистрируются аутоиммунные процессы. Наличие поврежденной, т.е. измененной в антигенном отношении ткани, ведет к развитию аутоиммунных реакций, интенсивность которых стимулируется адъювантным влиянием МБТ. Высокий уровень противолегочных антител отмечается при деструктивных процессах.
Существуют различные точки зрения на патогенетическую роль аутоиммунизации: одни авторы рассматривают ее как аутоагрессию, другие считают ее защитным процессом, третьи утверждают, что она никак не влияет на течение основного заболевания. По мнению К. Ф. Чернушенко, патогенетическая роль аутоиммунизации определяется ее степенью и выразительностью: умеренная — не имеет существенного выброса на течение основного (туберкулезного) заболевания, но высокий уровень аутоантител может быть фактором, который способствует развитию иммунологического воспаления — аутоагрессивной пневмонии, требующей специальной патогенетической терапии. Для диагностики аутоиммунизации используются различные реакции (агглютинации, связывания комплемента, ИФА и др.), Сложность их выполнения заключается в отсутствии стандартных тканевых антигенов.
Интенсивность специфических реакций, обусловленных вторичной микрофлорой, и аутоиммунных процессов в значительной степени определяется состоянием иммунной системы, особенно ее регуляторной звена. Характер выявленных нарушений зависит от ряда факторов — степени интоксикации, наличия биологически активных веществ, нарушений в других органах, состояния нервной и эндокринной систем и т. д.
В клинической практике иммунологические исследования у больных туберкулезом используются не только для целей диагностики и выяснения состояния иммунной системы пациента, но могут иметь значение и для определения прогноза течения заболевания, выявления возможного рецидива. Особое значение имеет анализ неспецифических и специфических показателей, продолжительности сохранения значительных нарушений, сопоставление их и: клинико-рентгенологической симптоматикой процесса. Длительное сохранение Т-клеточного дефицита, высоких уровней ауто- и противотуберкулезных антител, отсутствующей или пониженной реакции лимфоцитов на туберкулин характерно для прогрессирующего течения туберкулеза. Наличие указанных признаков еще на ранних этапах наблюдения должно быть основой для включения патогенетических средств в комплексную терапию туберкулеза.
Иммунологические исследования могут быть использованы и для определения эффективности лечения и полноты выздоровления больных. Сравнивая характер нарушений в иммунной системе к лечению, в процессе проведения терапии и после ее завершения, можно выявить определенную динамику изменений. В большинстве случаев при эффективной терапии происходит улучшение иммунологических показателей, а в некоторых больных — их нормализация. Однако клиническое выздоровление обычно опережает нормализацию иммунного статуса.
В случае сохранения туберкулезного воспаления иммунологические показатели длительное время могут оставаться измененными, особенно специфические тесты. Длительное сохранение значительных нарушений является основанием для пересмотра проводимой терапии и решения вопроса о назначении иммунокоректирующих препаратов. При применении последних следует учитывать характер выявленных иммунологических изменений с определением преимущественно возбужденного звена иммунной системы, степени чувствительности ИКК к назначенному препарату. Для этого существуют специальные иммунологические методы отбора иммунокоректирующих препаратов, основанных на определении характера действия их различных доз.
Тщательный анализ характера нарушений функционального состояния иммунной системы, интенсивности специфических и неспецифических реакций иммунокомпетентных клеток, клинической симптоматики, оценка состояния различных органов и систем может определить терапевтическую тактику врача у постели больного туберкулезом.
Источник