Реакция бласттрансформации лимфоцитов это
РБТЛ используется для определения физиологической активности (пролиферативного потенциала) клеток на неспецифические активаторы (митогены) и специфические антигены. Принцип реакции – активация лимфоцитов под влиянием стимулов с последующей трансформацией их в бласты. В качестве активаторов чаще всего используют ФГА (фитогемагглютинин) и конканавалин А (Кон-А).
В пробирку с питательной средой №199 помещают исследуемые лимфоциты и добавляют ФГА. Инкубируют 72-96 часов при 37оС. Пробирку без добавления ФГА используют как контроль. Пробирки центрифугируют. Из осадка готовят мазки, окрашивают по Романовскому- Гимзе.
Оценка результатов. В контрольной пробирке бластных клеток нет, а в опытной должно быть 60-80% бластных клеток. Сниженное количество бластов свидетельствует о снижении пролиферативной активности лимфоцитов.
Лимфоциты Трансформация в бласты
РТМЛ – РЕАКЦИЯ ТОРМОЖЕНИЯ МИГРАЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ
Принцип метода.
РТМЛ является одним из методов оценки функционального состояния Т- системы иммунитета. В основе реакции лежит способность Т-лимфоцитов выделять биологически активные субстанции – лимфокины, в том числе и факторы, ингибирующие миграцию лейкоцитов. Так, в нормальных условиях лейкоциты, помещенные в питательную среду при 37оС, способны мигрировать, образуя через 18-24 часа так называемую зону миграции. Если в среду для культивирования добавить митоген (например, ФГА) или антиген, к которому сенсибилизирован организм, то лимфоциты, содержащиеся в культуре, активируются и начинают продуцировать фактор торможения миграции. При этом величина зоны миграции резко уменьшается. По степени торможения миграции лейкоцитов можно судить о лимфокинпродуцирующей способности иммунокомпетентных клеток, а, следовательно, об их функциональной активности. Есть несколько вариантов проведения реакции, один из них – капиллярный, для которого используют пятиканальные капилляры Трошанова.
Сравнивая зону миграции без митогена (контроль) с таковой в присутствии митогена (опыт), определяют индекс миграции (ИМ).
эритроциты+ лейкоциты
гранулоциты
| …… | |
| ….. | |
| ….. | |
| ….. | |
| …… |
опыт (гепаринизированная кровь пациента +питательная среда+ ФГА/ Аг)
контроль (гепаринизированная кровь +питательная среда)
| …………………………… | |
| …………………………… | |
| ……………………………… | |
| …………………………… | |
| ……………………………… |
Оценка результатов:
ИМ– индекс миграции лейкоцитов
ИМ = S опыт/S контроль. Норма (с ФГА) – 0,2-0,8.
В норме происходит выработка фактора торможения миграции лейкоцитов. Этот процесс может быть нарушен при ИД состоянии тогда индекс приближается к 1.
При проведении РТМЛ с антигенами (лекарства, аллергены, вакцины и т.д.) ИМ равный или менее 0,7 учитывается как положительный результат, свидетельствующий о сенсибилизации организма к данному антигену. У здорового человека в этом случае ИМ =1 (±0,2).
Оценка гуморального звена иммунитета
ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ МЕТОДОМ РАДИАЛЬНОЙ ИММУНОДИФФУЗИИ
ПО МАНЧИНИ
Иммуноглобулины классов G, A и M определяются в сыворотке пациента (сывороточные иммуноглобулины) и в секретах (секреторные иммуноглобулины).По механизму это реакция преципитации в геле. Для её проведения необходимы агар и сыворотки, содержащие антитела к иммуноглобулинам человека. Ранее моноспецифические сыворотки к иммуноглобулинам человека получали при иммунизации ими кролика.
IgG человека кролик 1 Ат к IgG человека
IgA человека кролик 2 Ат к IgA человека
IgM человека кролик 3 Ат к IgM человека
В настоящее время такие антитела получают с помощью гибридом, то есть используют моноклональные антитела.
К расплавленному теплому агару добавляют сыворотку, содержащую Ат к IgG человека, заливают на стекло ровным слоем, дают застыть, делают лунки, заливают в лунки разведения контрольной сыворотки (с известным содержанием IgG) и исследуемые сыворотки:
Разведения контрольной сыворотки:
Цельная 1/2 1/4 1/8 1/16
1 2 3 4 5 1,2,3,4,5 –
сыворотки пациентов
После инкубации измеряют диаметр преципитации колец контрольной сыворотки, строят график (соотношение концентрации Ig и диаметров колец), затем измеряют диаметры исследуемых сывороток и по графику определяют концентрацию иммуноглобулинов в сыворотке больного.
Аналогично определяют и другие иммуноглобулины.
Метод высоко информативен в диагностике первичных и вторичных иммунодефицитных состояниях и хронических инфекциях. Иммуноглобулины снижаются при некоторых иммунодефицитных состояниях (когда нарушается выработка иммуноглобулинов), повышаются при миеломной болезни (злокачественное разрастание одного из клонов В-лимфоцитов и, как следствие, бесконтрольная продукция иммуноглобулинов).
IgM повышается – при перинтальных инфекциях (цитомегаловирусная, токсоплазмоз, краснуха, и др. вирусные инфекции); также повышается при острых септических состояниях, инфекционном мононуклеозе, микоплазменной пневмонии, вирусных гепатитах, циррозе, ревматоидном артрите, особенно в начальном, трудном для диагностики периоде артритов, при обострении СКВ. При некоторых заболеваниях повышение уровня Ig М свидетельствует о хроническом процессе.
IgM снижается – при первичных и вторичных ИД состояниях, при гастроэнтеропатиях, ожоговой болезни, иммунодепрессивной терапии.
IgGповышается – при разных заболеваниях, его повышение часто сопутствует активности процесса. Высокие концентрации данного иммуноглобулина наблюдаются при аутоиммунных процессах, острых инфекционных состояниях в фазу вторичного иммунного ответа. Увеличение концентрации моноклональных IgG имеет место при IgG-миеломе, бессимптомной моноклональной гаммапатии (редкие случаи).
IgG снижается – при первичных и вторичных ИД, при гастроэнтеритах с потерей белка, при нефротическом синдроме, при иммунодепрессивной терапии.
IgA повышается – при перинатальных инфекциях, хронических заболеваниях печени, подострых и хронических инфекциях, аутоиммунных заболеваниях, IgA – миеломе, бессимптомной гипергаммаглобулинемиии (редкие случаи).
IgA снижается – при ИД, ожоговой болезни, селективном дефиците IgA. Лица с дефицитом IgA предрасположены к хроническим воспалительным, аутоиммунным и аллергическим заболеваниям.
В настоящее время всё более широкое распространение получают более современные методы определения уровня иммуноглобулинов: ИФА, нефелометрический, турбодиметрический.
ЦИК ПО ХАШКОВОЙ
Метод основан на способности ПЭГ (полиэтиленгликоля) преципитировать иммунные комплексы (т.е. комплексы Аг/Ат). По концентрации белка в преципитате судят о количестве ЦИК.
Норма для взрослых: 24 – 84 ед.
ЦИК – это нормальное явление для организма и уровень его повышается при любых острых воспалительных заболеваниях на непродолжительное время.
Высокий уровень ЦИК является один из показателей воспаления и тканевого повреждения. Высокий уровень ЦИК, как правило, коррелирует с активностью патологического процесса при аутоиммунных заболеваниях.
Низкий уровень ЦИК наблюдается редко, и как правило, бывает у маленьких детей и больных с низким содержанием белка в плазме крови.
Оценка фагоцитарного звена
Источник
БЛАСТОТРАНСФОРМАЦИЯ ЛИМФОЦИТОВ (греч, blastos росток, зародыш + лат. transformare преобразовывать, превращать) — одно из проявлений реакции иммунной системы на действие антигена (аллергена) в виде трансформации зрелых лимфоцитов в малодифференцированные клетки типа бластов.
Антигенная стимуляция вызывает ответную реакцию иммунной системы организма, связанную как с гуморальными, так и клеточными факторами. Одной из стадий этого сложного процесса является действие антигена (аллергена) на малые лимфоциты, в результате чего последние начинают трансформироваться в малодифференцированные клетки типа бластов (пролимфоциты, лимфобласты, ретикулярные клетки) и пролиферировать. Это явление и обозначается как бластная трансформация лимфоцитов или реакция бластотрансформации лимфоцитов.
При первичном контакте организма с аллергеном последний действует на некоммитированные, или необученные, малые лимфоциты, индуцируя их превращение в бласты. Однако интенсивность Б. л. при этом незначительна. Затем в определенной части случаев из этих бластов образуются уже обученные, или коммитированные, лимфоциты (так наз. клетки памяти), которые по своим морфол, данным также являются малыми лимфоцитами. Повторное попадание аллергена в организм вызывает более выраженную Б. л., т. к. аллерген действует уже на коммитированные лимфоциты.
Свойство коммитированных лимфоидных клеток давать более выраженную Б. л. используется как тест для выявления аллергена, который сенсибилизировал организм.
Специфическая сенсибилизация может быть выявлена по отношению к самым различным аллергенам: бактериальным, грибковым, лекарственным, пищевым, бытовым, пыльцевым. Реакция Б. л. позволяет выявить повышенную чувствительность как замедленного, так и немедленного типов. Результаты, полученные с помощью Б. л. in vitro, соответствуют результатам, получаемым in vivo (кожные, провокационные тесты). Кроме того, наряду с другими тестами Б. л. позволяет осуществлять контроль за эффективностью гипосенсибилизирующей и иммунодепрессивной терапии при аллергических и аутоиммунных состояниях. Качественная и количественная характеристика Б. л. в значительной степени определяется источником лимфоцитов (периферическая кровь, лимф, узлы, грудной проток, селезенка, тимус, костный мозг, T- или B-лимфоциты), способом культивирования, дозой и видом аллергена. Большое значение при этом имеет подбор оптимальной концентрации аллергена, т. к. малые концентрации аллергена могут оказаться неэффективными, а большие дозы вызвать неспецифический токсический эффект.
Существует целый ряд модификаций реакции Б. л. in vitro. Одна из модификаций заключается в следующем: в асептических условиях из вены берется 5—10 мл крови в пробирку, содержащую 100—200 ЕД гепарина. Содержимое пробирки осторожно перемешивают и оставляют на 60 мин. в термостате при t° 37° для осаждения эритроцитов, к-рое может быть ускорено добавлением декстрана, желатины и др. После инкубации в термостате надосадочный слой плазмы, обогащенный лейкоцитами, отсасывают в отдельную стерильную пробирку. Определяют число лейкоцитов в 1 мл. Затем взвесь лейкоцитов разводят питательной средой 199 (содержащей 200 ЕД пенициллина и 100 ЕД стрептомицина в 1 мл) таким образом, чтобы в 1 мл содержалось 1 000 000—2 000 000 лейкоцитов, 20% аутологичной плазмы и 80% культуральной среды. Приготовленную лейкоцитарную взвесь разливают в стерильные флаконы по 1 мл, добавляют 0,1 мл предварительно оттитрованного аллергена и пропускают газовую смесь, содержащую 5% углекислого газа. Флаконы закрывают пробками и помещают в термостат при t° 37° на 5—7 дней. За это время культура лейкоцитов периферической крови освобождается от сегментоядерных лейкоцитов, исключая эозинофилы, и содержит преимущественно одноядерные клетки, которые идентифицируются как малые, средние и большие лимфоциты, бласты, ретикулярные клетки и макрофаги.
Интенсивность Б. л. оценивается различными методами. Морфол, метод заключается в подсчете в окрашенном мазке активированных клеток-бластов на 1000 клеток и определении их процентного содержания. Реакция расценивается как положительная, если число активированных клеток составляет не менее 4% от общего числа культивируемых клеток; максимальное число активированных клеток при действии специфического аллергена может достигать 35%. Изотопный метод позволяет определить общую активность культур лимфоцитов путем подсчета включенного в клетки, синтезирующие ДНК, меченого 3H-тимидина, добавляемого в культуральную среду.
Достоверность реакции Б. л. проверяется контрольными исследованиями с культурой исследуемых лимфоцитов без добавления аллергена (для выявления спонтанной Б. л.) и с культурой лимфоцитов здоровых людей, инкубируемой с соответствующим аллергеном.
Разрабатываются методики, при которых исследуемый аллерген вводится в организм, после чего культивируются лейкоциты периферической крови по описанному выше методу. По-видимому, в этом случае аллерген стимулирует лимфоциты непосредственно в организме, а бластотрансформация их выявляется при культивировании. Так, напр., у больного с пищевой аллергией прием пищевого аллергена per os вызывает активную бластотрансформацию в культуре лимфоцитов, полученных из их крови. Этот тест, очевидно, может иметь значение и в случаях лекарственной аллергии, когда аллергеном является не само лекарство, а его метаболит.
Б. л. без добавления аллергена может выявляться при культивировании лейкоцитов из крови больных с аутоаллергическими болезнями в связи с присутствием в организме аутоаллергенов (см. Аутоаллергия). По своей интенсивности она превосходит спонтанную Б. л. у здоровых людей.
На интенсивность Б. л. оказывают влияние такие факторы, как стадия заболевания, возраст, интеркуррентные инфекции, предшествующая терапия. Так, стероидные гормоны и другие иммунодепрессанты (антиметаболиты, алкилирующие вещества) в значительной степени ослабляют Б. л.
Б. л. является также одним из тестов для выявления некоторых видов иммунодефицитных заболеваний (см. Иммунологическая недостаточность), связанных с недостаточностью клеточного механизма иммунитета (при аллергической реакции замедленного типа). В этих случаях в различной степени ослаблена интенсивность Б. л. на специфические антигены и на неспецифические стимулы. К последним относятся фитогемагглютинин, антилимфоцитарная сыворотка, которые в интактном организме вызывают интенсивную Б. л., достигающую 95%.
Из дополнительных материалов
Б. л. — одно из проявлений реакции иммунной системы на действие антигена (аллергена или митогена) в виде трансформации малых лимфоцитов в малодифференцированные клетки типа бластов и их пролиферации. Возможность трансформации лимфоцитов в культурах была отмечена в начале 19 в. А. А. Максимовым и другими исследователями. В дальнейшем широкое распространение получило представление, что из лимфоцитов крови могут образовываться макрофаги (см.) и другие виды клеток. Однако в начале 70-х гг. 20 в. было установлено, что в процессе Б. л. из малых лимфоцитов образуются только стимулированные лимфоциты и в культурах можно обнаружить различные переходные формы лимфоцитов от малого лимфоцита до типичного лимфобласта.
Феномен Б. л. широко используется для диагностики специфической сенсибилизации организма к различным аллергенам и для оценки состояния иммунол, реактивности. Для выявления специфической сенсибилизации обычно in vitro к лимфоцитам, полученным из крови исследуемого, добавляют различные аллергены, затем определяют интенсивность Б. л. Оценку иммунол, реактивности таким же способом проводят с неспецифическими митогенами: фитогемагглютинином (ФГА), экстрактом лаконоса, конканавалином А, липополисахаридами кишечной палочки или сальмонелл и др., а также с такими широко распространенными антигенами, как очищенный белковый препарат туберкулина, стрептокиназа-стрептодораза, кандидин и др. Нек-рые из неспецифических митогенов (напр., ФГА) стимулируют реакцию бластотрансформации преимущественно Т-лимфоцитов, другие (напр., липополисахариды) — В-лимфоцитов. Результаты неспецифической Б. л. дают только нек-рые представления о состоянии иммунол, реактивности организма и для полноты этих представлений требуются другие методы исследования. Существует два типа методов реакции Б. л. in vitro: методы с предварительно изолированными лимфоцитами и методы культивирования цельной крови.
Библиография: Линг Η. Р. Стимуляция лимфоцитов, пер. с англ., М., 1971; Руководство по иммунологии, под ред. О. Е. Вязова и Ш. X. Ходжаева, с. 350, М., 1973; Хальперн Б., Ки Н. и Амач Н. Тест трансформации лимфоцитов (ТТЛ) в специфической диагностике лекарственной аллергии, в кн.: Пробл, иммунол, реактивности и аллергии, под ред. А. М. Чернуха и Л. М. Ишимовой, с. 136, М., 1971; May С. D. a. Alberto R. In vivo stimulation of peripheral lymphocytes to proliferation after oral challenge of children allergic to foods, Int. Arch. Allergy, v. 43, p. 525, 1972, bibliogr.; Иммунологические методы, под ред. X. Фримеля, пер. с нем., М., 1979; Линг H. Р. Стимуляция лимфоцитов, пер. с англ., М., 1971; Чернушенко Е.Ф. и Когосова Л. С. Иммунологические исследования в клинике, Киев, 1978; Guillоux L., Ville G. et Quenin P. Test de transformation lvmplioblastique, Rev. Inst. Pasteur Lyon, t. 11, p. 549, 1978.
Т. М. Царегородцева, В. И. Пыцкий, А. B. Барышева.
Источник
Реакция бласттрансформации — это превращение лимфоцитов под влиянием различных стимуляторов, в том числе чужеродных антигенов, в способные к делению бластоподобные формы.
Состояние напоминает изменения, которые проявляются в лимфатических узлах после иммунизации. В основе реакции лежит способность Т-лимфоцитов при контакте с чужеродными клетками превращаться в юные (бластные) формы, способные делиться и активно синтезировать ДНК.
Особое значение имеет реакция бласттрансформации в смешанной культуре. При совместном культивировании генетически различающихся лимфоцитов они распознают чужеродные антигены и трансформируются в бластные формы. В образовании бластных форм принимают участие лимфоциты обоих генотипов. Для упрощения реакции и придания ей однонаправленности подавляют (облучением или актиномицином) пролиферативную активность лимфоцитов донора. Лимфоциты реципиента распознают антигены чужеродных клеток донора и вступают в реакцию бласттрансформации (рис. 19.1).
Постановка реакции бласттрансформации между лимфоцитами донора и реципиента является обязательным условием перед проведением операций по пересадке органов. Чем меньше выраженность реакции, тем больше совместимость тканей и, следовательно, выше вероятность приживления трансплантата.
Рис. 19.1. Реакция бласттрансформации в смешанной культуре тканей
Цитопатогенный эффект сенсибилизированных лимфоцитов обеспечивает деструкцию чужеродных клеток, что лежит в основе трансплантационного иммунитета. Т-лимфоциты, полученные от иммунизированных чужеродными клетками животных, оказывают цитотоксическое действие на эти клетки. Цитотоксическое действие реализуется путем прикрепления лимфоцитов к чужеродным клеткам за счет «структурных антител». Сенсибилизированные лимфоциты несут их на поверхности клеточной мембраны. Именно они начинают разрушать чужеродные клетки. В дальнейшем к специфическим иммунологическим механизмам цитопатогенности присоединяются неспецифические механизмы разрушения клеток за счет действия ферментов. Цитолитическое действие Т-лимфоцитов усиливается за счет содержащихся в них перфоринов, которые «просверливают» отверстия в мембране клетки, и гранзимов, которые «впрыскиваются» в эти отверстия и переваривают клетки.
Реакция бласттрансформации и цитопатогенное действие лимфоцитов — это два основных этапа трансплантационного иммунитета. Бласттрансформация — процесс первичного распознавания чужеродных клеток Т-лимфоцитами. Цитопатогенное действие сенсибилизированных Т-лимфоцитов — завершающий этап трансплантационного иммунитета. Эти два клеточных феномена могут развиваться в культуре тканей вне организма.
Помимо иммунных Т-лимфоцитов-киллеров, цитопатогенный эффект оказывают NK-клетки (естественные киллеры), которые относятся к нулевым лимфоцитам. На их клеточной мембране нет рецепторов, характерных для В- или Т-клеток. Для проявления цито- патогенного действия NK-клеток не требуется присутствия антител или комплемента. Оно проявляется без предварительного контакта NK-клетки с антигеном. В этом состоит отличие цитопатогенного действия естественных киллеров от цитопатогенного действия сенсибилизированных Т-лимфоцитов-киллеров. NK-клетки формируют противоопухолевый иммунитет организма.
Источник