Пролиферативная активность т лимфоцитов
- Иммунология и аллергология
- Иммунология
- Иммунология : практикум : учеб, пособие
Лимфоциты — единственный тип клеток крови, для которых пролиферация в периферических тканях является физиологической нормой и обязательным этапом в развитии иммунного ответа. Поэтому количественная оценка пролиферативной активности лимфоцитов в спланированных экспериментальных условиях может служить мерой реактивности лимфоцитов на тот или иной внешний стимул. Если такой внешний стимул — специфический антиген, то уровень пролиферативного ответа лимфоцитов допустимо расценить как показатель иммуногенности препарата, содержащего антиген (способности вызывать на себя иммунный ответ), или численности клона(ов), реагирующих на данный антиген лимфоцитов.
Существуют вещества, которые называют митогенами за их способность вызывать деление клеток. Митогены обусловливают поликлональную или олигоклональную пролиферацию лимфоцитов. Первым случайно обнаруженным в процессе рутинных работ в банке крови по гемагглютинации эритроцитов митогеном лимфоцитов стал лектин фитогемагглютинин (ФГА) из обыкновенной фасоли Phaseolus vulgaris, способный агглютинировать эритроциты только определенного серологического типа. ФГА — сильный мито- ген, индуцирующий переход клеток из стадии G2 в митоз. Впервые ФГА выделен из фасоли П. Новеллом в 1960 г. С тех пор появился новый метод оценки пролиферативной активности лимфоцитов человека и экспериментальных жиротных, получивший название бласттрансформация. Оказалось, ФГА вызывает митотическое деление преимущественно Т-лимфоцитов. Также преимущественное митогенное действие в отношении Т-лимфоцитов оказывает лектин конканавалин А, выделенный из растений семейства бобовых
Canavalia ensiforme. В последнее время получили широкое распространение моноклональные антитела (монАТ) против CD3 или CD28 антигенов (как наиболее мощные поликлональные стимуляторы Т-лимфоцитов).
Митоген (pokeweed mitogen) из корня растения лаконоса Phytolacca americana стимулирует пролиферацию и В- и Т-лимфоцитов, а кроме того вызывает поликлональную продукцию иммуноглобулинов В-лимфоцитами. Пролиферацию преимущественно В-лимфоцитов вызывают препараты липополисахаридов (ЛПС) эндотоксинов из грамотрицательных бактерий.
Методы оценки пролиферативной активности лимфоцитов в культуре in vitro рассчитаны на выявление и измерение уникального для клеточного деления процесса — удвоения ДНК в S-фазе митоза.
Методов существует несколько.
- Исторически первый метод — микроскопический (морфологический). Клетки, прошедшие S-фазу, но еще не прошедшие митоз, имеют двойное количество ДНК и остальных компонентов хромосом. Соответственно вся клетка больше по размеру, чем неделя- щиеся клетки, что хорошо видно на препаратах мазков или даже в живой культуре под световым микроскопом. Микроскопический метод детекции клеток в S-фазе называют «реакцией бласттранс- формации» и в настоящее время используют по крайней мере для демонстрации бластных и других форм лимфоцитов. Помимо поликлональной активации Т- и В-лимфоцитов, достаточно широко используются методы, основанные на стимуляции антиген/аллерген- специфических клонов Т- и В-клеток. Естественно, что в последнем случае число трансформированных клеток может быть мало. Для их подсчета морфологический метод не пригоден.
В лабораторной генетике реакцию бласттрансформации лимфоцитов применяют с целью визуализации хромосом и анализа кариотипа человека. Для остановки клеточного цикла на стадии митоза используют колхицин.
- Колорометрический метод. Он основан на использовании внутриклеточных прижизненных красителей, включаемых в цепи ДНК. Это, например, МТТ — 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолиум бромид.
- Микроцитофлуорометрический метод (FACS). Он основан на использовании флюоресцентных красителей, включаемых в цепи ДНК, с оценкой на проточном цитометре.
- Радиоизотопный метод. Он основан на использовании меченых нуклеотидов, включаемых в состав только ДНК, в частности тими- дина (3H-Td) — (3-излучатель, уридина 14C-Td — у-излучатель или 1311-дезоксиуридина — у-излучатель.
«Золотым стандартом» для оценки пролиферации является последний метод — радиоизотопный, поскольку с его помощью подсчитывают не только клетки, находящиеся в данный момент в S-фазе, но и уже поделившиеся дочерние клетки, которые другие названные методы уже «не видят». Опишем кратко метод оценки пролиферации по включению 3Н-тимидина.
- Создают экспериментальную систему стимуляции лимфоцитов in vitro: это может быть внесение антигена, митогена или других стимулирующих агентов (цитокины, антитела против поверхностных антигенов и др.). Время культивирования лимфоцитов зависит от стимулятора: для митогенов — обычно 72 ч, для антигена — до 6— 7 сут.
Б. За 4—24 ч до остановки эксперимента in vitro вводят меченый тимидин. Чаще всего используют метил-3Н-тимидин. Удельная радиоактивность препарата — около 1—2 Кю/мкмоль. Если удельная активность коммерческого препарата выше, то его разводят «холодным» (т.е. нерадиоактивным) тимидином до заданной величины, чтобы избежать «тимидинового самоубийства» живых клеток. Готовят матричный раствор тимидина в культуральной среде: как правило, его концентрация составляет 20 мкКю/мл. Если эксперимент проводят in vitro в лунках с объемом 200 мкл, то в каждую лунку вносят по 25 мкл матричного раствора 3Н-тимидина, что создает его рабочую концентрацию 0,5 мкКю на лунку. Количество клеток в лунке при этом, как правило, составляет 1—5х105.
- По завершении культивирования в присутствии 3Н-тимидина клетки удаляют из лунок прибором харвестером на непроницаемые для клеток микропористые фильтры, геометрически соответствующие формату лунок культуральных плашек. Фильтры промывают от невключившегося в клеточную ДНК 3Н-тимидина, после чего сушат при 60—80 °С под инфракрасной лампой или феном.
Г. Каждый фильтр помещают в индивидуальный флакон с сцин- тилляционной жидкостью и в специальном счетчике (3-частиц просчитывают число импульсов в минуту (срт) и определяют индекс стимуляции. Его значение и является количественным показателем уровня пролиферации исследуемых клеток. Показатели экспериментальных лунок сравнивают с контрольными и рассчитывают статистическую достоверность различий.
Источник: под ред. Л. В. Ковальчука, Г. А. Игнатьевой, Л. В. Ганковской., «Иммунология : практикум : учеб, пособие» 2010
А так же в разделе «ОЦЕНКА ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ »
- ОЦЕНКА КЛЕТОЧНОЙ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ
- Лабораторная работа 3-1
- Определение перфорина методом ELISPOT
- Связывание с тетрамерными структурами МНС класса I
- Определение каспаз методом проточной цитофлуорометрии
- Определение цитотоксической активности NK-клеток
- Лабораторная работа 3-2
- Оценка функциональной активности NK-клеток с использованием проточной цитометрии
- Комплементзависимая цитотоксичность
- ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ФАГОЦИТОВ
- Лабораторная работа 3-3 Определение фагоцитарной активности нейтрофилов и макрофагов
- Лабораторная работа 3-4 Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов человека
- Метод оценки хемотаксиса нейтрофилов с использованием камеры Бойдена
- Особенности постановки методов оценки хемотаксиса in vitro
- Лабораторная работа 3-5 Получение супернатанта, содержащего цитокины и другие биологически активные молекулы из моноцитов периферической крови человека
- Определение выработки активных форм кислорода и оксида азота
- Описание метода люминолзависимой хемилюминесценции
- Определение содержания NO в супернатантах культуры фагоцитов in vitro
- Оценка киллинга фагоцитов
- Определение активности миелопероксидазы в лейкоцитах периферической крови
- Количественная оценка антителообразующих клеток (метод Йерне)
- Постановка реакции выявления АОК (метод Н. Йерне)
Источник
Лимфоцитарная пролиферация злокачественных лимфом кожи.
Распределение лимфоцитов в коже в зависимости от фенотипа, которое наблюдается в физиологических условиях, находит отражение в развитии лимфопролиферативных заболеваний: Т-лимфопролиферативные опухоли развиваются обычно в верхних слоях дермы и для них характерен экзоцитоз лимфоцитов в эпидермис вплоть до образования внутриэпидермальных микроабсцессов из Т-лимфоцитов (эпидермотропизм). В-лимфопролиферативные процессы возникают в глубоких слоях дермы и обычно не носят эпидермотропный характер. Эти опухоли значительно чаще бывают при системных лимфопролиферативных процессах.
В группе злокачественных лимфом кожи удельный вес заболеваний, в основе которых лежит Т-лимфоцитарная пролиферация, значительно превосходит удельный вес В-лимфом, что отражает реальное соотношение Т- и В-лимфоцитов в нормальной коже. Поданным G. Burg, Т-лимфомы кожи составляют приблизительно 65% всех вариантов ЗЛК, В-лимфомы кожи — 25%, 10% приходится на неклассифицируемые лимфомы.
В нормальной коже лимфоциты в периваскулярных областях представлены почти одинаковым количеством хелперов и супрессоров, хелперносупрессорный индекс обычно равен 0,93—0,96. Встречается также определенное количество клеток, обладающих киллерной активностью (натуральные киллеры).
Т-клеточные лимфомы обычно протекают с преимущественной пролиферацией лимфоцитов, имеющих хелперный фенотип, гораздо реже пролиферируют клетки с супрессорным или киллерным фенотипом.
Преобладание пролиферации Т-лимфоцитов с фенотипом Т-хелперов у больных ЗЛК, возможно, связано с тропностью вирусов типа HTVL-1 к субпопуляции Т-хелперов и способностью этих вирусов к длительной персистенции в таких клетках. Известно, что большая часть Т-лимфом кожи, в том числе наиболее распространенное заболевание этой группы — грибовидный микоз и его лейкемический вариант — синдром Сезари, протекают с преимущественной пролиферацией Т-хелперов, в частности Т2-хелперов-клеток памяти.
Сопоставление клинического течения злокачественных лимфом кожи с принадлежностью клона пролиферирующих злокачественных клеток к определенной субпопуляции Т-лимфоцитов показало, что тяжесть течения заболевания не определяется происхождением злокачественного клона из Т-хелперов, супрессоров или киллеров. Следует учитывать, что фенотип пролиферирующих клеток может меняться. Описаны случаи развития Т-клеточной лимфомы (грибовидного микоза) через год после появления клинически типичной и подтвержденной фе-нотипически В-клеточной лимфомы. Злокачественная Т-лимфома кожи может также предшествовать развитию В-клеточной лимфомы, что объясняют рядом причин: мутагенным действием полихимиотерапии, стимуляцией В-лимфоцитов патологическим клоном Т-лимфоцитов и др. Известны случаи сочетания Т- и В-лимфомы у одного больного, когда поражение кожи протекало по типу Т-лимфопролиферативного процесса, а в периферической крови и регионарных лимфатических узлах обнаруживали атипичные В-лимфоциты.
В процессе развития опухоли лимфопролиферативного характера происходит изменение характера экспрессии обычных антигенов лимфоцитами, потеря некоторых из них и появление дополнительных маркеров, подтверждающих злокачественность клональных пролиферирующих лимфоцитов. При этом происходят следующие иммунофенотипические изменения клеток появление клеток с аберрантным фенотипом (когда на атипичных лимфоцитах определяются маркеры как Т-, так и В-лимфоци-тов или маркеры Т-хелперного и Т-супрессор-ного фенотипа одновременно), а также лимфоцитов, имеющих маркеры незрелых клеток или характеризующихся потерей одного или нескольких панантигеноь. Кроме того, пролиферация клеток сопровождается повышенной экспрессией некоторых других антигенов, в частности антигена ядер пролиферирующих клеток – Ki-67. Наличие большого количества лимфоцитов с указанными имму-нофенотипическими признаками в клеточном составе пролиферата очагов поражения кожи, крови, лимфатических узлах и внутренних органах (при метастазировании) обычно является признаком тяжелого клинического течения процесса и плохого прогноза.
С развитием молекулярной иммунологии и иммуногенетики появились новые методы, позволяющие с высокой чувствительностью определять клетки злокачественного клона лимфоцитов по маркерам, отражающим перегруппировки или поломки на уровне генных структур клеток (генотипирование клеток). Так, с помощью методов блот-гибридизации по Southern и ПЦР у больных различными клиническими формами ЗЛК удается определять злокачественные клетки, экспрессирующие онкобелки семейства с-тус и c-ras, отражающие нарушение функционирования генов, ответственных за пролиферацию клеток. Кроме того, с помощью ПЦР удается обнаруживать лимфоциты с переустройством структуры Т-клеточного рецептора (TCR), что маркирует перегруппировку гена Т-клеточного рецептора и является признаком злокачественности Т-лимфоцитов. При этом могут определяться изменения структуры как фиксированных цепей TCR (аи(3), так и вариабельных частей этих рецепторов (TCR-V).
Атипичные лимфоциты с перегруппировкой TCR обнаруживают у больных ЗЛК в крови, лимфатических узлах, пораженной коже уже на ранних стадиях заболевания. Значительно чаще определяются лимфоциты с маркерами, отражающими перегруппировку а- и [3- цепей TCR, что обычно сочетается с наличием налим-фоцитах маркеров CD4H и CD45RO+. Гораздо реже встречаются варианты атипичных лимфоцитов с маркерами переустройства у- и 8-цепей TCR (так называемые у-5-Т-клеточные лимфомы). Экспрессия у, 8-рецепторов TCR чаще сочетается с экспрессией CD4+, реже CD8+ маркеров, однако в редких случаях оба эти рецептора (CD4 и CD8) могут не экспрессироваться. Обычно лимфоциты с у- 5-рецепторным комплексом не проявляют тропности к эпидермису. Кожные Т-лимфомы, в основе развития которых лежит пролиферация лимфоцитов с переустройством у- и 5-цепей TCR, обычно характеризуются агрессивным клиническим течением опухолей и плохим прогнозом. При ВЗЛК генотипический анализ выявляет в злокачественных В-лимфоцитах перестройки в генах, кодирующих тяжелые цепи иммуноглобулинов, что также является признаком злокачественности таких клеток.
– Также рекомендуем “Роль нарушения апоптоза в развитии злокачественных лимфом кожи.”
Оглавление темы “Злокачественные лимфомы кожи.”:
1. Патогенез злокачественных лимфом кожи.
2. Роль вирусов в развитии злокачествнных лимфом кожи.
3. Вирусы HTLV-1 в развитии злокачествнных лимфом кожи.
4. Антитела к вирусу HTLV-1 в развитии злокачествнных лимфом кожи.
5. Роль вируса Эпстайна — Барр развитии злокачествнных лимфом кожи.
6. Роль производственных вредностей в развитии злокачественных лимфом кожи.
7. Звенья патогенеза злокачественных лимфом кожи.
8. Лимфоцитарная пролиферация злокачественных лимфом кожи.
9. Роль нарушения апоптоза в развитии злокачественных лимфом кожи.
10. Классификация злокачественных лимфом кожи.
Пролиферация В-клетки. Дифференцировка В-клетки
Какие же ответные реакции вызывают в В-клетке воздействующие на нее активирующие сигналы? Некоторые исследователи считают, что первый сигнал не приводит к видимым изменениям в В-лимфоците. Взаимодействие антигенных детерминант с иммуноглобулиновыми рецепторами на поверхности В-клетки является лишь стадией селекции и обеспечивает чувствительность данного В-лимфоцита к последующим стимулам. Только второй сигнал, исходящий от Т-клеток-помощников или митогенов, индуцирует пролиферацию, дифференцировку и последующую антителопродукцию.
Однако имеются работы, в которых показано, что пролиферация и дифференцировка В-клетки — это два раздельных этапа ее активации, вызванные разными сигналами. Взаимодействие антигенных детерминант с иммуноглобулиновыми рецепторами приводит к блаеттрансформации В-лимфоцита, синтезу ДНК и пролиферации. Второй сигнал, генерируемый Т-клетками, обеспечивает дифференцировку уже размножающихся В-лимфоцитов в зрелые антителопродуценты.
Доказательства такой последовательности процессов пролиферации и дифференцировки были получены в опытах с использованием культуры клеток селезенки бестимусных мышей. Ответ к тимусзависимому антигену (эритроцитам осла) получали при добавлении в культуру Т-клеток. Сила ответа не зависела от того, вводились ли Т-клетки в культуру одновременно с антигеном или через 40 час после антигенной стимуляции, что свидетельствует о развитии пролиферативных процессов в В-клетках без участия Т-лимфоцитов (Dutton, 1975).
Индукция пролиферации в В-клетках до поступления второго сигнала показана также в опытах с временным блокированием размножения В-лимфоцитов го-, рячим 3Н-тимидином. Добавление Т-клеток в культуру после удаления Н-тимидина не приводило к повышению ответа (Dutton, 1975).
Эти данные свидетельствуют о том, что помощь со стороны Т-клеток требуется уже размножающимся В-лимфоцитам. Не исключено, однако, что специфический медиатор, выделяемый Т-клетками, необходим в момент антигенного воздействия, поскольку есть сведения о его участии в преобразовании антигена в иммуногенную форму (Feldmann, Basten, 1972).
Рассмотренные кооперативные процессы между макрофагами, Т-лимфоцитами и В-лимфоцитами обеспечивают включение (triggering) иммунного ответа при антигенной стимуляции. Они протекают на уровне предшественников антителообразующих клеток и инициируют вступление В-лимфоцитов в пролиферацию и дифференцировку. Т-лимфоциты и макрофаги выступают в данном случае в роли вспомогательных клеток, необходимых для активации В-лимфоцитов. Помимо инициирующих антителогенез взаимодействий, существуют супрессирующие кооперативные процессы, которые рассмотрены в следующих статьях сайта.
В последние годы стало известно, что Т-лимфоциты, помимо функции клеток-помощников при индукции иммунной реакции, могут выполнять роль клеток-супрессоров. Ингибирующее влияние на иммунный ответ обнаружено также и со стороны В-лимфоцитов и макрофагов. Эти супрессирующие клеточные взаимодействия играют, очевидно, ведущую роль в регуляции иммунного ответа и в настоящее время активно изучаются.
– Также рекомендуем “Супрессивное действие Т-клеток. Т-клетки-супрессоры”
Оглавление темы “Супрессия иммунного ответа. Клетки супрессоры”:
1. Антителогенез. Роль макрофагов в индукции антителогенеза
2. Взаимодействие Т- и В-лимфоцитов. Взаимодействие лимфоцитов и макрофагов
3. Модель активации В-клетки. Индукция антителообразования
4. Гипотеза двух сигналов. Схемы взаимодействия Т и В лимфоцитов
5. Пролиферация В-клетки. Дифференцировка В-клетки
6. Супрессивное действие Т-клеток. Т-клетки-супрессоры
7. Свойства и особенности Т-супрессоров. Взаимодействия Т-супрессоров
8. Супрессорная активность Т-супрессоров. Механизм действия Т-супрессоров на антителообразование
9. В-клетки-супрессоры. Супрессия иммунного ответа В-лимфоцитами
10. Супрессорная функция макрофагов. Кооперация зрелых антителопродуцентов
Источник