Понятие популяция и субпопуляция лимфоцитов

В-лимфоциты.

B-лимфоциты относятся к наиболее важным клеточным элементам иммунной системы, предназначенным для реализации гуморального иммунитета посредством специфических антител. Зрелые B-клетки, морфологически подобны лимфоцитам, поступают в кровоток из костного мозга, пейеровых бляшек и из других органов. Затем они заселяют периферические лимфоидные органы, где под влиянием факторов роста и созревания и специфического антигена в специальных зонах (вторичные фолликулы лимфоидной паренхимы в лимфатических узлах, белая пульпа селезенки, миндалины и другие) дифференцируются в плазматические клетки, синтезирующие и продуцирующие антитела. Формирующийся B-клеточный клон обеспечивает выработку антител одной специфичности. Отличительная особенность созревающих и зрелых B-лимфоцитов заключается в наличии поверхностных иммуноглобулиновых молекул. Они являются рецепторами для антигена. Кроме иммуноглобулиновых рецепторов, на B-клетках экспрессируется ряд других поверхностных маркеров.

T-лимфоциты.

Среди клеточных элементов иммунной системы несомненное лидерство как по количественным, так и функциональным параметрам принадлежит T-лимфоцитам. Это клетки происходят из полипотентной стволовой клетки и через ряд стадий дифференцировки в костном мозге (лимфоидная стволовая клетка, общая для B- и T-клеток) приобретают способность к миграции в тимус, где окончательно созревают в функционально полноценную иммунокомпетентную клетку. Внутритимический этап развития T-лимфоцитов определяет формирование высоко специализированных клеток. Среди T-клеток выделяют T-хелперы, T-индукторы, T-супрессоры, T-цитоксические клетки, T_эффекторы гиперчувствительности замедленного типа. Именно эти клетки определяют практически полной спектр клеточных реакций иммунитета, включая реакции гиперчувствительности замедленного типа, противоопухолевого и трансплантационного иммунитета и многие другие.

Помимо эффектной функции, у лимфоцитов высоко развита иммунорегуляторная активность. Известно, что на тимусзависимые антигены B-лимфоциты не могут развивать адекватный иммунный ответ без помощи субпопуляции T-лимфоцитов, являющихся T-хелперами, в то время как другая субпопуляция T-лимфоцитов (T-супрессоры) обладает негативным действием на развитие и реализацию иммунных процессов. Разнообразны регуляторные влияния T-лимфоцитов на клетки моноцитарно-макрофагального ряда. Распознавание антигенного материала путем восприятия его поверхности антиген-представляющих моноцитарно-макрофагальных клеток с последующим запуском активационных процессов, отражает уникальную способность T-клеток инициировать иммунную реакцию.

T-лимфоциты хелперы/индукторы.

Они являются наиболее важными клеточными элементами иммунной системы. Именно T-хелперы (помощники) включают B-лимфоциты в развитие, обеспечивающее накопление соответствующего клона зрелых антителопродуцентов, интенсивно синтезирующих антитела против иммунизирующего антигена. Первый этап этого процесса начинается с распознавания Т – хелперами антигенных молекул, которые были предварительно переработаны антигенпредставляющими клетками моноцитарно-макрофагального ряда. В последующем T-хелперы синтезируют растворимые факторы (интерлейкин – 2 и другие), помогающие B-лимфоцитам превращаться в антителопродуцирующие клетки, а также регулировать другие иммунные реакции.

T-лимфоциты супрессоры.

T-супрессоры выполняют одну из основных рягуляторных ролей в иммунных реакциях воздействуя на T- и B-клетки. Основное их предназначение – негативная регуляция иммунного ответа. Под влиянием этих клеток тормозятся выработка антител, цитоксические и другие реакции. Данная субпопуляция T-лимфоцитов угнетает иммунную реакцию специфически, то есть в отношении того антигена, который ее не индуцирует, и неспецифически в отношении многих других антигенов. Следует отметить, что окончательное созревание функционально активных T-супрессоров зависит от T-хелперов.

T-цитотоксические клетки.

T-цитотоксические клетки выполняют эффекторную (киллерную) функцию и поэтому их называют T-киллеры. Эти лимфоциты способны специфически разрушать (лизировать) чужеродные опухолевые клетки, клетки мишени, пораженные вирусом (например, клетки печени, инфицированные вирусом гепатита B). Особенностью их действия, отличающегося от естественных клеток киллеров (NK), является необходимость предварительного контакта с антигеном и последующего развития в так называемые сенсибилизированные T_лимфоциты. последние будут разрушать клетки, на которых присутствует антиген, вызывающий их специализацию. При взаимодействии с клеткой мишенью T-киллеры выделяют цитотоксические факторы (лимфотоксин, перфорин и др.), под влиянием которых нарушается целостность клеточной мембраны чужеродной клетки и она лизируется.

Цитотоксические T-клетки в основном находятся в периферических органах и тканях иммунной системы (лимфатические узлы, селезенка, лимфоидные скопления в слизистых и т.д.), а также в различных участках организма, где непосредственно развивается реакция клеточного иммунного ответа. В небольшом количестве цитотоксические T-лимфоциты присутствуют в периферической крови, но подсчитать их отдельно доступными методами не удается, так как они имеют сходные с T-супрессорами поверхностные маркеры (CD2,CD3,CD8 и др.).

В литературе имеется значительное число сообщений по отдельным аспектам иммунитета и неспецифической иммунологической резистентности при хирургических заболеваниях с гнойно-воспалительными осложнениями местного и системного характера (Колкер И.И., Вишневская С.М., Панова Ю.М., 1985; Шкроб Л.О. , Лукоянова Т. Н., Вишневская С.М. и др., 1990; Назарова И. П., Попов А.А., Мальцева М. А. и др., 1994).

Проблема лечения неспецифической инфекции и ее гнойно- септических осложнений за последние годы приобрела особую остроту практически во всех сферах клинической практики. Использование современных антибиотиков, способствующих селекции высокорезестентных штаммов, внедрение методов иммунодепрессивной терапии, экологические факторы, все это способствует росту осложненных форм хирургической инфекции (Черных Е.Р., 1997).

Одной из ведущих причин возникновения осложненного течения бактериальной инфекции являются нарушения в иммунной системе. Поэтому перспективы лечения данного контингента больных связывают с внедрением методов иммунокоррекции и в частности, с использованием цитокинов (Ерюхин И.А.,1997; Ковальчук Л.В. и др., 1997).

Первым исследованием всегда является подсчет лейкоцитарной формулы (см. главу «Гематологические исследования»). Оцениваются как относительные, так и абсолютные значения количества клеток периферической крови.

Определение основных популяций (Т-клетки, В-клетки, натуральные киллеры) и субпопуляций Т-лимфоцитов (Т-хелперы, Т-ЦТЛ). Для первичного исследования иммунного статуса и выявления выраженных нарушений иммунной системы ВОЗ рекомендовано определение CD3, CD4, CD8, CD19, CD16+56, соотношение CD4/CD8. Исследование позволяет определить относительное и абсолютное количество основных популяций лимфоцитов: Т-клетки – CD3, В-клетки – CD19, натуральные киллеры (NK) – CD3- CD16++56+, субпопуляции Т лимфоцитов (Т-хелперы CD3+ CD4+, Т-цитотоксические CD3+ CD8+ и их соотношение).

Метод исследования

Иммунофенотипирование лимфоцитов проводится c использованием моноклональных антител к поверхностным дифференцировочным ангинам на клетках иммунной системы, методом проточной лазерной цитофлуорометрии на проточных цитофлуориметрах.

Выбор зоны анализа лимфоцитов производится по дополнительному маркеру CD45, который представлен на поверхности всех лейкоцитов.

Условия взятия и хранения образцов

Венозная кровь, взятая из локтевой вены, утром, строго натощак, в вакуумную систему до указанной на пробирке метки. В качестве антикоагулянта используется К2ЭДТА. После взятия пробирку с образцом медленно переворачивают 8-10 раз для перемешивония крови с антикоагулянтом. Хранение и транспортировка строго при 18–23°С в вертикальном положении не более 24 ч.

Невыполнение этих условий приводит к некорректным результатам.

Интерпретация результатов

Т-лимфоциты (CD3+ клетки). Повышенное количество свидетельствует о гиперактивности иммунитета, наблюдается при острых и хронических лимфолейкозах. Увеличение относительного показателя встречается при некоторых вырусных и бактериальных инфекциях в начале заболевания, обострениях хронических заболеваний.

Снижение абсолютного количества Т-лимфоцитов свидетельствует о недостаточности клеточного иммунитета, а именно о недостаточности клеточно-эффекторного звена иммунитета. Выявляется при воспалениях разнообразной этиологии, злокачественных новообразованиях, после травмы, операций, инфаркта, при курении, приеме цитостатиков. Повышение их числа в динамике заболевания – клинически благоприятный признак.

В-лимфоциты (CD19+ клетки) Снижение наблюдается при физиологических и врожденных гипогаммаглобулинемиях и агаммаглобулинемиях, при новообразованиях иммунной системы, лечении иммунодепрессантами, острой вирусной и хронической бактериальной инфекциях, состоянии после удаления селезенки.

Увеличение отмечается при аутоиммунных заболеваниях, хронических заболеваниях печени, циррозе, муковисцедозе, бронхиальной астме, паразитарных и грибковых инфекциях. Характерно в период реконвалесценции после перенесенных острых и хронических вирусных и бактериальных инфекций. Выраженное увеличение наблюдается при хроническом В-лимфолейкозе.

NK-лимфоциты с фенотипом CD3-CD16++56+ Натуральные киллеры (NK-клетки) – популяция больших гранулярных лимфоцитов. Они способны лизировать клетки-мишени, инфицированные вирусами и другими внутриклеточными антигенами, опухолевые клетки, а также другие клетки аллогенного и ксеногенного происхождения.

Увеличение количества NK-клеток связано с активацией антитрансплантационного иммунитета, в некоторых случаях отмечается при бронхиальной астме, встречается при вирусных заболеваниях, повышается при злокачественных новообразованиях и лейкозах, в периоде реконвалесценции.

Снижение наблюдается при врожденных иммунодефицитах, паразитарных инфекциях, аутоиммунных заболеваниях, облучении, лечении цитостатиками и кортикостероидами, стрессе, дефиците цинка.

Т-лимфоциты хелперы с фенотипом CD3+CD4+ Увеличение абсолютного и относительного количества наблюдается при аутоиммунных заболеваниях, может быть при аллергических реакциях, некоторых инфекционных заболеваниях. Это увеличение свидетельствует о стимуляции иммунной системы на антиген и служит подтверждением гиперреактивных синдромов.

Снижение абсолютного и относительного количества Т-клеток свидетельствует о гипореактивном синдроме с нарушением регуляторного звена иммунитета, является патогномичным признаком для ВИЧ-инфекции; встречается при хронических заболеваниях (бронхитах, пневмониях и т.д.), солидных опухолях.

Т-цитотоксические лимфоциты с фенотипом CD3+ CD8+ Повышение выявляется практически при всех хронических инфекциях, вирусных, бактериальных, протозойных инфекциях. Является характерным для ВИЧ-инфекции. Снижение наблюдается при вирусных гепатитах, герпесе, аутоиммунных заболеваниях.

Соотношение CD4+/CD8+ Исследование соотношения CD4+/CD8+ (CD3, CD4, CD8, CD4/CD8) рекомендовано только для мониторинга ВИЧ-инфекции и контроля эффективности АРВ терапии. Позволяет определить абсолютное и относительное количество Т-лимфоцитов, субпопуляций Т-хелперов, ЦТЛ и их соотношение.

Диапазон значений – 1,2–2,6. Снижение наблюдается при врожденных иммунодефицитах (синдром Ди-Джоржи, Незелофа, Вискотта-Олдрича), при вирусных и бактериальных инфекциях, хронических процессах, воздействии радиации и токсических химических веществ, множественной миеломе, стрессе, снижается с возрастом, при эндокринных заболеваниях, солидных опухолях. Является патогномичным признаком для ВИЧ-инфекции (менее 0,7).

Увеличение значения более 3 – при аутоиммунных заболеваниях, остром Т-лимфобластном лейкозе, тимоме, хроническом Т-лейкозе.

Изменение соотношения может быть связано с количеством хелперов и ЦТЛ у данного пациента. Например, снижение количества CD4+ Т-клеток при острой пневмонии в начале заболевания ведет к снижению индекса, а ЦТЛ при этом могут не измениться.

Для дополнительного исследования и выявления изменений иммунной системы при патологиях требующих оценки наличия острого или хронического воспалительного процесса и степени его активности, рекомендуется включать подсчет количества активированных Т-лимфоцитов с фенотипом CD3+HLA-DR+ и ТNK–клеток с фенотипом CD3+CD16++56+.

Т-активированные лимфоциты с фенотипом CD3+HLA-DR+ Маркер поздней активации, показатель гиперреактивности иммунитета. По экспрессии данного маркера можно судить о выраженности и силе иммунного ответа. Появляется на Т-лимфоцитах после 3-го дня острого заболевания. При благоприятном течении заболевания снижается до нормы. Увеличение экспрессии на Т-лимфоцитах может быть при многих заболеваниях, связанных с хроническим воспалением. Отмечено его повышение у пациентов с гепатитом С, пневмониями, ВИЧ-инфекцией, солидными опухолями, аутоиммунными заболеваниями.

ТNK-лимфоциты с фенотипом CD3+CD16++CD56+ Т-лимфоциты, несущие на своей поверхности маркеры CD16++ CD 56+. Эти клетки имеют свойства как Т-, так и NK-клеток. Исследование рекомендовано как дополнительный маркер при острых и хронических заболеваниях.

Снижение их в периферической крови может наблюдаться при различных органоспецифических заболеваниях и системных аутоиммунных процессах. Увеличение отмечено при воспалительных заболеваниях разной этиологии, опухолевых процессах.

Исследование ранних и поздних маркеров активации Т-лимфоцитов (CD3+CD25+, CD3-CD56+, CD95, CD8+CD38+) дополнительно назначают для оценки изменений ИС при острых и хронических заболеваниях, для диагностики, прогноза, мониторинга течения заболевания и проводимой терапии.

Т-активированные лимфоциты с фенотипом CD3+CD25+, рецeптор к ИЛ2 CD25+ – маркер ранней активации. О функциональном состоянии Т-лимфоцитов (CD3+) свидетельствует количество экспрессирующих рецепторов к ИЛ2 (CD25+). При гиперактивных синдромах количество этих клеток возрастает (острые и хронические лимфолейкозы, тимома, отторжение трансплантата), кроме того, повышение их может свидетельствовать о ранней стадии воспалительного процесса. В периферической крови их можно выявить в первые три дня болезни. Снижение числа этих клеток может наблюдаться при врожденных иммунодефицитах, аутоиммунных процессах, ВИЧ-инфекции, грибковых и бактериальных инфекциях, ионизирующей радиации, старении, отравлении тяжелыми металлами.

Т-цитотоксические лимфоциты с фенотипом CD8+CD38+ Присутствие CD38+ на ЦТЛ лимфоцитах отмечено у пациентов с разными заболеваниями. Информативный показатель при ВИЧ-инфекции, ожоговой болезни. Увеличение числа ЦТЛ с фенотипом CD8+CD38+ наблюдается при хронических воспалительных процессах, онкологических и некоторых эндокринных заболеваниях. При проведении терапии показатель снижается.

Субпопуляция натуральных киллеров с фенотипом CD3- CD56+ Молекула CD56 – адгезивная молекула, широко представленная в нервной ткани. Кроме натуральных киллеров, экспрессируется на многих типах клеток, в том число на Т-лимфоцитах.

Увеличение данного показателя свидетельствуют о расширении активности специфического клона клеток киллеров, которые имеют меньшую цитолитическую активность, чем NK-клетки с фенотипом CD3- CD16+. Количество этой популяции возрастает при гематологических опухолях (ЕК-клеточная или Т-клеточная лимфома, плазмоклеточная миелома, апластическая крупноклеточная лимфома), хронических заболеваниях, некоторых вырусных инфекциях.

Снижение отмечается при первичных иммунодефицитах, вирусных инфекциях, системных хронических заболеваниях, стрессе, лечении цитостатиками и кортикостероидами.

Рецептор CD95+ – один из рецепторов апоптоза. Апоптоз – сложный биологический процесс, необходимый для удаления из организма поврежденных, старых и инфицированных клеток. Рецептор CD95 экспрессируется на всех клетках иммунной системы. Он играет важную роль в контроле функционирования иммунной системы, так как является одним из рецепторов апоптоза. Его экспрессия на клетках определяет готовность клеток к апоптозу.

Снижение доли CD95+-лимфоцитов в крови пациентов свидетельствует о нарушении эффективности последнего этапа выбраковки дефектных и инфицированных собственных клеток, что может привести к рецидиву заболевания, хронизации патологического процесса, развитию аутоиммунных заболеваний и повышению вероятности опухолевой трансформации (к примеру, рака шейки матки при папилломотозной инфекции). Определение экспрессии CD95 имеет прогностическое значение при миело- и лимфопролифератиных заболеваниях.

Повышение интенсивности апоптоза наблюдается при вирусных заболеваниях, септических состояниях, при употреблении наркотических средств.

Активированные лимфоциты CD3+CDHLA-DR+, CD8+CD38+, CD3+CD25+, CD95. Тест отражает функциональное состояние Т-лимфоцитов и рекомендован для контроля за течением заболевания и контроля иммунотерапии при воспалительных заболеваниях разной этиологии.