Методика выделения лимфоцитов крови

Глава 29. Иммунологические методы

ВЫДЕЛЕНИЕ ПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ

Для проведения многих иммунологических исследований in vivo и in vitro требуются те или иные популяции лимфоцитов. Их получают от экспериментальных животных, в основном из тимуса, селезенки и периферических лимфоузлов. Некоторые специальные исследования требуют выделения клеток из других участков организма, например и з пейеровых бляшек. Рециркулирующие клетки можно получить путем канюлирования грудного лимфатического протока и сбора клеток в течение нескольких часов. У человека наиболее легко выделить лимфоциты периферической крови, а хирургическим путем можно получить также клетки селезенки, ми н дат и н и лимфоузлов. Однако хирургически отобранный материал часто содержит инфекционные агенты или опухолевые клетки, в зависимости от заболевания, которое вызвало необходимость хирургического вмешательства. Следует иметь в виду, что клеточные популяции, содержащиеся в перечисленных тканях, совершенно различны как но степени зрелости лимфоцитов, так и по численному соотношению в них клеток разных типов.

Тимус является источником довольно чистой Т-клеточной популяции, однако составляющие ее лимфоциты различаются по степени зрелости. При работе с лимфоцитами из других органов и тканей часто возникает необходимость в выделении отдельных субпопуляций для анализа их особых функций. Применение с этом целью описанного выше проточного флуоресцентного клеточного сортера, позволяющего разделять лимфоциты но их поверхностным маркерам, позволяет получать лишь ограниченное число клеток, поскольку скорость цитометрии с сортировкой весьма низка. Существует, однако, и ряд методов, позволяющих выделять лимфоциты и их отдельные субпопуляции сразу из всего объема исследуемого образца, – центрифугирование в градиенте плотности, розеткообразование, пэннинг и магнитное разделение.

Выделение в градиенте плотности основано на том, что лимфоциты имеют меньшую плотность, чем эритроциты и гранулоциты (рис. 29.19). Этот способ позволяет выделять большую часть лимфоцитов крови. Розеткообразование и пэннинг («просеивание» через подложку) используют для выделения субпопуляций (рис. 29.20 и 29.21). Пэннинг представляет собой разновидность аффинной хроматографии применительно к лимфоцитам. На сходном принципе основан и способ разделения с помощью магнитных гранул, покрытых специфическими антителами (например, анти-СD4). При смешивании с клетками гранулы связывают тс из них, которые распознаются фиксированными антителами. Эти клетки можно затем смыть с гранул или выделить путем наложения магнитного поля.

Рис. 29.19. Лимфоциты можно выделить из цельной крови в градиенте плотности фиколла. Для этого кровь дефибринируют путем встряхивания со стеклянными бусами и образовавшийся сгусток удаляют. Затем кровь разводят культуральной средой и наслаивают на раствор фиколла, заполняющий пробирку до половины. Плотность фиколла выше, чем плотность лимфоцитов, но ниже, чем плотность эритроцитов и гранулоцитов (например, нейтрофилов). После центрифугирования эритроциты и полиморфноядерные нейтрофилы (ПЯН), прошедшие через фиколл, образуют на дне пробирки осадок в виде пуговки, тогда как лимфоциты остаются на границе между средой, в которой они взвешены, и фиколлом. Препарат лимфоцитов освобождают затем от макрофагов и оставшихся ПЯН, добавляя в него железные опилки, они фагоцитируются, и поглотившие их фагоциты можно удалить при помощи сильного магнита. Макрофаги могут быть удалены и другим способом: клеточную суспензию помещают в пластиковую чашку; макрофаги прилипают к поверхности пластика и в суспензии остаются только лимфоциты.

Рис. 29.20. Метод розеткообразования основан на том, что лимфоциты некоторых субпопуляций несут рецепторы, связывающиеся с эритроцитами. Т-клетки человека имеют рецепторы для эритроцитов барана (Э) – молекулы CD2 (1). На Т-клетках мыши число таких рецепторов невелико, поэтому Т-лимфоциты мыши изолировать подобным способом невозможно. При смешивании Т-клетки вместе с эритроцитами образуют «розетки», которые могут быть отделены от неспособных к розеткообразованию В-клеток в градиенте плотности фиколла. Существует также модификация этого метода, позволяющая выделять клетки с другими рецепторами (2). Например. Тγ-лимфоциты (Т-клетки, несущие рецептор для Fc-фрагмента IgG, Fcγ) можно идентифицировать и выделить методом розеткообразования с эритроцитами быка, сенсибилизированными субагглютинирующим количеством антител к этим эритроцитам. На микрофотографии (3) виден лимфоцит, образовавший розетку с эритроцитами. (Фото любезно предоставлено д-ром Р. М. Lydyard).

Рис. 29.21. Клеточные популяции можно разделять на подложках, сенсибилизированных антителами. Нанесенные на подложку антитела нековалентно связываются с поверхностью пластика (как при иммуносорбентном анализе), после чего на нее наносят суспензию клеток. Антиген-положительные клетки (Аг+) связываются с антителами, тогда как антиген-отрицательные (Аг+) можно удалить осторожным смыванием. Связанные клетки иногда удается отделить от подложки, изменив условия культивирования или обработав клетки ферментами. Часто связывание клеток с иммобилизованным антигеном вызывает в них те или иные изменения; например, при связывании антигена с пластиком могут возникать перекрестные связи между его молекулами, в результате чего он активирует клетки. Данный метод наиболее подходит для удаления субпопуляций, а не для их выделения из общей популяции лимфоцитов. В качестве примеров применения данного метода можно назвать разделение популяций Тх- и Тц-клеток при помощи антител анти-СD4 или анти-CD8 и отделение Т-клеток от В-лимфоцитов с использованием антител анти-lg (которые связываются с поверхностными антителами В-клеток). При обратной постановке (сенсибилизация подложки антигеном) связывающие антиген клетки можно отделять от несвязывающих.

Другой способ — он применяется для удаления ненужной клеточной популяции, — основан на использовании антител и комплемента. Если к смеси клеток добавить специфические антитела (например, анти-CDS), а затем комплемент, клетки соответствующей субпопуляции будут лизированы. Конечно, для этого метода пригодны лишь такие антитела, которые связывают комплемент; кроме того, клетки-мишени должны нести на поверхности достаточное количество молекул антигена, чтобы фиксировать литическую дозу комплемента.

Источником определенных популяций лимфоцитов могут служить антигенспецифичные Т-клеточные линии, культивируемые в течение длительного периода (рис. 29.22). Получение таких линий позволяет обойтись без частого выделения первичных культур из органов и тканей животных.

Рис. 29.22. Одна из возможных процедур получения Т-клеточных линий. Мышей примируют антигеном, вводя его обычно под кожу на подошвенной стороне задней лапки. Через неделю у животных удаляют дренирующие эту область лимфоузлы (в данном случае подколенные и паховые), и полученные из них клетки культивируют в присутствии антигена на питающем подслое из сингенных (т. е. от мышей той же инбредной линии) клеток, например нормальных лимфоцитов или спленоцитов. Через 4 сут из культуры выделяют лимфобласты и индуцируют их пролиферацию с помощью ИЛ-2. Когда число клеток достаточно возрастет, проверяют их МНС- и антигенспецифичность в реакции трансформации лимфоцитов, Полученную линию культивируют попеременно на питающем подслое из клеток, стимулированных антигеном, и в ИЛ-2-содержащей среде.

Для определения наличия и концентрации иммунокомпетентных клеток в донорской крови, использовался счетчик форменных элементов крови «Пикоскель ПС-4М». Данный счетчик используется в медицинской практике для счета форменных элементов крови: числа эритроцитов, лейкоцитов, и тромбоцитов.

Для «Пикоскеля ПС-4М» наиболее важными техническими характеристиками являются:

– определяемая концентрация форменных элементов крови от 2·103 до 105 см-3;

– определяемые размеры форменных элементов от 2 до 12 мкм;

– систематическая погрешность не более 15 %;

– случайная погрешность не более 4%;

– время измерения одной пробы не более 40 с.

Работа счётчика форменных элементов крови «Пикоскель ПС-4М» построена на принципе измерения импеданса и реализована на счёте электрических импульсов, вызванных исследуемыми частицами, проходящими через отверстие измерительной трубки. Исследуемые частицы помещаются с помощью дозирующих устройств в электропроводящую жидкость (электролит), который совместно с ними представляет собой вид суспензии.

При запуске цикла измерения в измерительной трубке возникает вакуум, под действием которого находящиеся в электролите частицы засасываются в измерительную трубку через отверстие. Когда уровень суспензии внутри измерительной трубки достигает первого внутреннего электрода, между ним и внешним электродом протекает постоянный по величине измерительный ток. Электрическое сопротивление между электродами значительно изменяется каждый раз, когда через отверстие измерительной трубки проходят частицы с электропроводимостью, отличающейся от электропроводимости электролита. Изменение сопротивления создает импульсы напряжения. Подключенный к электродам регистрирующий узел может определить концентрацию частиц. Когда внутри измерительной трубки уровень суспензии достигает второго внутреннего электрода, в измерительной трубке создаётся давление, под действием которого тот же самый объём суспензии из неё выталкивается и, находящиеся в нём частицы, снова проходят через измерительную трубку.

Подсчёт частиц всегда происходит в постоянном объёме измерительной трубки, ограниченном первым и вторым внутренними электродами. По окончании цикла измерения результаты счёта можно снять с дисплея счётчика или распечатать.

Для определения значения фона. Была установлена измерительная трубка, затем в измерительный стакан налили 10 мл чистого физиологического раствора с последующим добавлением трех капель гемолитика. Далее стакан с физиологическим раствором был установлен на столик. После был выбран режим для измерения лейкоцитов при измерительном токе 200 мкА. Значение фона составило 0,7·109 шт/л.

Для подсчета частиц крови одинаково пригодна кровь, взятая из вены в пробирку (цельная), а так же проба крови, взятая из кончика пальца (периферическая).

Для проведения данного опыта была использована цельная кровь, отобранная у здоровых и больных (ВПР ЧЛО) доноров.

Проведение измерения числа лейкоцитов производилось следующим образом. Измерительная трубка была установлена на 100 мкм, затем был выбран режим счета лейкоцитов WBC, с последующим выбором тока 200 мкА. Далее разбавляем кровь физиологическим раствором в пропорции 1:630 (16 мкл крови на 10 мл физиологического раствора) и добавляем три капли гемолизируюющего раствора (гемолитика). Спустя три минуты полученный раствор был установлен на измерительный столик и производим счет лейкоцитов.

Были определено, что в одном литре крови доноров содержится 4,6·109 штук лейкоцитов. Лимфоциты составляют 28% от общего числа лейкоцитов, следовательно, их концентрация 1,288·109шт/л.

Для выделения лимфоцитарной массы из цельной крови была использована методика [36]. Метод основан на разделении клеток крови при центрифугировании в градиенте плотности фиколла-урагрофина.

За сутки до выделения лимфоцитов из цельной крови, необходимо приготовить раствор фиколла-урографина с плотностью 1,093 г/мл. Раствор фиколла-урографина готовился следующим образом: в небольшом количестве дистиллированной теплой воды растворили 4,1 г фиколла 400, добавили 10 мл 76 % урографина и добавили дистиллят. Приготовленный раствор оставили на сутки. На следующий день довели водой до нужной плотности. Плотность раствора измеряли с помощью ареометра.

Для каждого исследуемого образца промаркировали по два эппендорфа вместимостью 1,5 мл – A и B. В пробирки, маркированные A, внесли с помощью дозатора по 500 мкл 0,9 % раствора NaCl стерильного, а затем таким же образом, поместили 500 мкл цельной крови и аккуратно смешали кровь с физраствором, тем самым стабилизировав кровь.

В эппендорфы, маркированные В, стерильных, внесли по 500 мкл фиколл-урографина. На фиколл-урографин аккуратно, избегая смешивания, наслаивали стабилизированную кровь, а затем, закрыв эппендорфы, поместили их в центрифугу Sigma 1-14 на 20 мин при скорости вращения равной 400 об/мин. По истечению 20 мин, содержимое эппендорфа представляло собой следующий гетерофазный раствор. На дно выпадал осадок красного цвета из эритроцитов и тромбоцитов, т. к. их плотность выше плотности фиколла-урографина. Надосадочная жидкость разделилась на две фазы: прозрачная – фиколл-урографин и красная жидкость, представляющая собой плазму крови. На границе раздела этих двух фаз образовалось кольцо из бело-желтых сгустков, содержащее лимфоциты. С помощью микродозатора производился сбор межфазного кольца, содержимое которого было помещено в отдельный стерильный эппендорф для дальнейшей отмывки клеток от примесей. Для отмывки клеток был добавлен физраствор в количестве 500 мкл, а затем эппендорфы снова были помещены в центрифугу на 10 мин со скоростью вращения 400 об/мин. После этого отбирали надосадочную жидкость. Выделенные лимфоциты цельной крови можно хранить при температуре минус 20 0С. На рисунке 2 представлена фотография выделенных лимфоцитов.

Рисунок 2 – Фотография выделенных лимфоцитов, сделанная на оптическом микроскопе БИОМЕД-6 Вар 3 при увеличении 1 : 1000

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ВЫДЕЛЕНИЕ ЛИМФОЦИТОВ