Как выделить из периферической крови лимфоциты
Глава 29. Иммунологические методы
ВЫДЕЛЕНИЕ ПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ
Для проведения многих иммунологических исследований in vivo и in vitro требуются те или иные популяции лимфоцитов. Их получают от экспериментальных животных, в основном из тимуса, селезенки и периферических лимфоузлов. Некоторые специальные исследования требуют выделения клеток из других участков организма, например и з пейеровых бляшек. Рециркулирующие клетки можно получить путем канюлирования грудного лимфатического протока и сбора клеток в течение нескольких часов. У человека наиболее легко выделить лимфоциты периферической крови, а хирургическим путем можно получить также клетки селезенки, ми н дат и н и лимфоузлов. Однако хирургически отобранный материал часто содержит инфекционные агенты или опухолевые клетки, в зависимости от заболевания, которое вызвало необходимость хирургического вмешательства. Следует иметь в виду, что клеточные популяции, содержащиеся в перечисленных тканях, совершенно различны как но степени зрелости лимфоцитов, так и по численному соотношению в них клеток разных типов.
Тимус является источником довольно чистой Т-клеточной популяции, однако составляющие ее лимфоциты различаются по степени зрелости. При работе с лимфоцитами из других органов и тканей часто возникает необходимость в выделении отдельных субпопуляций для анализа их особых функций. Применение с этом целью описанного выше проточного флуоресцентного клеточного сортера, позволяющего разделять лимфоциты но их поверхностным маркерам, позволяет получать лишь ограниченное число клеток, поскольку скорость цитометрии с сортировкой весьма низка. Существует, однако, и ряд методов, позволяющих выделять лимфоциты и их отдельные субпопуляции сразу из всего объема исследуемого образца, – центрифугирование в градиенте плотности, розеткообразование, пэннинг и магнитное разделение.
Выделение в градиенте плотности основано на том, что лимфоциты имеют меньшую плотность, чем эритроциты и гранулоциты (рис. 29.19). Этот способ позволяет выделять большую часть лимфоцитов крови. Розеткообразование и пэннинг («просеивание» через подложку) используют для выделения субпопуляций (рис. 29.20 и 29.21). Пэннинг представляет собой разновидность аффинной хроматографии применительно к лимфоцитам. На сходном принципе основан и способ разделения с помощью магнитных гранул, покрытых специфическими антителами (например, анти-СD4). При смешивании с клетками гранулы связывают тс из них, которые распознаются фиксированными антителами. Эти клетки можно затем смыть с гранул или выделить путем наложения магнитного поля.
Рис. 29.19. Лимфоциты можно выделить из цельной крови в градиенте плотности фиколла. Для этого кровь дефибринируют путем встряхивания со стеклянными бусами и образовавшийся сгусток удаляют. Затем кровь разводят культуральной средой и наслаивают на раствор фиколла, заполняющий пробирку до половины. Плотность фиколла выше, чем плотность лимфоцитов, но ниже, чем плотность эритроцитов и гранулоцитов (например, нейтрофилов). После центрифугирования эритроциты и полиморфноядерные нейтрофилы (ПЯН), прошедшие через фиколл, образуют на дне пробирки осадок в виде пуговки, тогда как лимфоциты остаются на границе между средой, в которой они взвешены, и фиколлом. Препарат лимфоцитов освобождают затем от макрофагов и оставшихся ПЯН, добавляя в него железные опилки, они фагоцитируются, и поглотившие их фагоциты можно удалить при помощи сильного магнита. Макрофаги могут быть удалены и другим способом: клеточную суспензию помещают в пластиковую чашку; макрофаги прилипают к поверхности пластика и в суспензии остаются только лимфоциты.
Рис. 29.20. Метод розеткообразования основан на том, что лимфоциты некоторых субпопуляций несут рецепторы, связывающиеся с эритроцитами. Т-клетки человека имеют рецепторы для эритроцитов барана (Э) – молекулы CD2 (1). На Т-клетках мыши число таких рецепторов невелико, поэтому Т-лимфоциты мыши изолировать подобным способом невозможно. При смешивании Т-клетки вместе с эритроцитами образуют «розетки», которые могут быть отделены от неспособных к розеткообразованию В-клеток в градиенте плотности фиколла. Существует также модификация этого метода, позволяющая выделять клетки с другими рецепторами (2). Например. Тγ-лимфоциты (Т-клетки, несущие рецептор для Fc-фрагмента IgG, Fcγ) можно идентифицировать и выделить методом розеткообразования с эритроцитами быка, сенсибилизированными субагглютинирующим количеством антител к этим эритроцитам. На микрофотографии (3) виден лимфоцит, образовавший розетку с эритроцитами. (Фото любезно предоставлено д-ром Р. М. Lydyard).
Рис. 29.21. Клеточные популяции можно разделять на подложках, сенсибилизированных антителами. Нанесенные на подложку антитела нековалентно связываются с поверхностью пластика (как при иммуносорбентном анализе), после чего на нее наносят суспензию клеток. Антиген-положительные клетки (Аг+) связываются с антителами, тогда как антиген-отрицательные (Аг+) можно удалить осторожным смыванием. Связанные клетки иногда удается отделить от подложки, изменив условия культивирования или обработав клетки ферментами. Часто связывание клеток с иммобилизованным антигеном вызывает в них те или иные изменения; например, при связывании антигена с пластиком могут возникать перекрестные связи между его молекулами, в результате чего он активирует клетки. Данный метод наиболее подходит для удаления субпопуляций, а не для их выделения из общей популяции лимфоцитов. В качестве примеров применения данного метода можно назвать разделение популяций Тх- и Тц-клеток при помощи антител анти-СD4 или анти-CD8 и отделение Т-клеток от В-лимфоцитов с использованием антител анти-lg (которые связываются с поверхностными антителами В-клеток). При обратной постановке (сенсибилизация подложки антигеном) связывающие антиген клетки можно отделять от несвязывающих.
Другой способ — он применяется для удаления ненужной клеточной популяции, — основан на использовании антител и комплемента. Если к смеси клеток добавить специфические антитела (например, анти-CDS), а затем комплемент, клетки соответствующей субпопуляции будут лизированы. Конечно, для этого метода пригодны лишь такие антитела, которые связывают комплемент; кроме того, клетки-мишени должны нести на поверхности достаточное количество молекул антигена, чтобы фиксировать литическую дозу комплемента.
Источником определенных популяций лимфоцитов могут служить антигенспецифичные Т-клеточные линии, культивируемые в течение длительного периода (рис. 29.22). Получение таких линий позволяет обойтись без частого выделения первичных культур из органов и тканей животных.
Рис. 29.22. Одна из возможных процедур получения Т-клеточных линий. Мышей примируют антигеном, вводя его обычно под кожу на подошвенной стороне задней лапки. Через неделю у животных удаляют дренирующие эту область лимфоузлы (в данном случае подколенные и паховые), и полученные из них клетки культивируют в присутствии антигена на питающем подслое из сингенных (т. е. от мышей той же инбредной линии) клеток, например нормальных лимфоцитов или спленоцитов. Через 4 сут из культуры выделяют лимфобласты и индуцируют их пролиферацию с помощью ИЛ-2. Когда число клеток достаточно возрастет, проверяют их МНС- и антигенспецифичность в реакции трансформации лимфоцитов, Полученную линию культивируют попеременно на питающем подслое из клеток, стимулированных антигеном, и в ИЛ-2-содержащей среде.
Источник
Первым исследованием всегда является подсчет лейкоцитарной формулы (см. главу «Гематологические исследования»). Оцениваются как относительные, так и абсолютные значения количества клеток периферической крови.
Определение основных популяций (Т-клетки, В-клетки, натуральные киллеры) и субпопуляций Т-лимфоцитов (Т-хелперы, Т-ЦТЛ). Для первичного исследования иммунного статуса и выявления выраженных нарушений иммунной системы ВОЗ рекомендовано определение CD3, CD4, CD8, CD19, CD16+56, соотношение CD4/CD8. Исследование позволяет определить относительное и абсолютное количество основных популяций лимфоцитов: Т-клетки – CD3, В-клетки – CD19, натуральные киллеры (NK) – CD3- CD16++56+, субпопуляции Т лимфоцитов (Т-хелперы CD3+ CD4+, Т-цитотоксические CD3+ CD8+ и их соотношение).
Метод исследования
Иммунофенотипирование лимфоцитов проводится c использованием моноклональных антител к поверхностным дифференцировочным ангинам на клетках иммунной системы, методом проточной лазерной цитофлуорометрии на проточных цитофлуориметрах.
Выбор зоны анализа лимфоцитов производится по дополнительному маркеру CD45, который представлен на поверхности всех лейкоцитов.
Условия взятия и хранения образцов
Венозная кровь, взятая из локтевой вены, утром, строго натощак, в вакуумную систему до указанной на пробирке метки. В качестве антикоагулянта используется К2ЭДТА. После взятия пробирку с образцом медленно переворачивают 8-10 раз для перемешивония крови с антикоагулянтом. Хранение и транспортировка строго при 18–23°С в вертикальном положении не более 24 ч.
Невыполнение этих условий приводит к некорректным результатам.
Интерпретация результатов
Т-лимфоциты (CD3+ клетки). Повышенное количество свидетельствует о гиперактивности иммунитета, наблюдается при острых и хронических лимфолейкозах. Увеличение относительного показателя встречается при некоторых вырусных и бактериальных инфекциях в начале заболевания, обострениях хронических заболеваний.
Снижение абсолютного количества Т-лимфоцитов свидетельствует о недостаточности клеточного иммунитета, а именно о недостаточности клеточно-эффекторного звена иммунитета. Выявляется при воспалениях разнообразной этиологии, злокачественных новообразованиях, после травмы, операций, инфаркта, при курении, приеме цитостатиков. Повышение их числа в динамике заболевания – клинически благоприятный признак.
В-лимфоциты (CD19+ клетки) Снижение наблюдается при физиологических и врожденных гипогаммаглобулинемиях и агаммаглобулинемиях, при новообразованиях иммунной системы, лечении иммунодепрессантами, острой вирусной и хронической бактериальной инфекциях, состоянии после удаления селезенки.
Увеличение отмечается при аутоиммунных заболеваниях, хронических заболеваниях печени, циррозе, муковисцедозе, бронхиальной астме, паразитарных и грибковых инфекциях. Характерно в период реконвалесценции после перенесенных острых и хронических вирусных и бактериальных инфекций. Выраженное увеличение наблюдается при хроническом В-лимфолейкозе.
NK-лимфоциты с фенотипом CD3-CD16++56+ Натуральные киллеры (NK-клетки) – популяция больших гранулярных лимфоцитов. Они способны лизировать клетки-мишени, инфицированные вирусами и другими внутриклеточными антигенами, опухолевые клетки, а также другие клетки аллогенного и ксеногенного происхождения.
Увеличение количества NK-клеток связано с активацией антитрансплантационного иммунитета, в некоторых случаях отмечается при бронхиальной астме, встречается при вирусных заболеваниях, повышается при злокачественных новообразованиях и лейкозах, в периоде реконвалесценции.
Снижение наблюдается при врожденных иммунодефицитах, паразитарных инфекциях, аутоиммунных заболеваниях, облучении, лечении цитостатиками и кортикостероидами, стрессе, дефиците цинка.
Т-лимфоциты хелперы с фенотипом CD3+CD4+ Увеличение абсолютного и относительного количества наблюдается при аутоиммунных заболеваниях, может быть при аллергических реакциях, некоторых инфекционных заболеваниях. Это увеличение свидетельствует о стимуляции иммунной системы на антиген и служит подтверждением гиперреактивных синдромов.
Снижение абсолютного и относительного количества Т-клеток свидетельствует о гипореактивном синдроме с нарушением регуляторного звена иммунитета, является патогномичным признаком для ВИЧ-инфекции; встречается при хронических заболеваниях (бронхитах, пневмониях и т.д.), солидных опухолях.
Т-цитотоксические лимфоциты с фенотипом CD3+ CD8+ Повышение выявляется практически при всех хронических инфекциях, вирусных, бактериальных, протозойных инфекциях. Является характерным для ВИЧ-инфекции. Снижение наблюдается при вирусных гепатитах, герпесе, аутоиммунных заболеваниях.
Соотношение CD4+/CD8+ Исследование соотношения CD4+/CD8+ (CD3, CD4, CD8, CD4/CD8) рекомендовано только для мониторинга ВИЧ-инфекции и контроля эффективности АРВ терапии. Позволяет определить абсолютное и относительное количество Т-лимфоцитов, субпопуляций Т-хелперов, ЦТЛ и их соотношение.
Диапазон значений – 1,2–2,6. Снижение наблюдается при врожденных иммунодефицитах (синдром Ди-Джоржи, Незелофа, Вискотта-Олдрича), при вирусных и бактериальных инфекциях, хронических процессах, воздействии радиации и токсических химических веществ, множественной миеломе, стрессе, снижается с возрастом, при эндокринных заболеваниях, солидных опухолях. Является патогномичным признаком для ВИЧ-инфекции (менее 0,7).
Увеличение значения более 3 – при аутоиммунных заболеваниях, остром Т-лимфобластном лейкозе, тимоме, хроническом Т-лейкозе.
Изменение соотношения может быть связано с количеством хелперов и ЦТЛ у данного пациента. Например, снижение количества CD4+ Т-клеток при острой пневмонии в начале заболевания ведет к снижению индекса, а ЦТЛ при этом могут не измениться.
Для дополнительного исследования и выявления изменений иммунной системы при патологиях требующих оценки наличия острого или хронического воспалительного процесса и степени его активности, рекомендуется включать подсчет количества активированных Т-лимфоцитов с фенотипом CD3+HLA-DR+ и ТNK–клеток с фенотипом CD3+CD16++56+.
Т-активированные лимфоциты с фенотипом CD3+HLA-DR+ Маркер поздней активации, показатель гиперреактивности иммунитета. По экспрессии данного маркера можно судить о выраженности и силе иммунного ответа. Появляется на Т-лимфоцитах после 3-го дня острого заболевания. При благоприятном течении заболевания снижается до нормы. Увеличение экспрессии на Т-лимфоцитах может быть при многих заболеваниях, связанных с хроническим воспалением. Отмечено его повышение у пациентов с гепатитом С, пневмониями, ВИЧ-инфекцией, солидными опухолями, аутоиммунными заболеваниями.
ТNK-лимфоциты с фенотипом CD3+CD16++CD56+ Т-лимфоциты, несущие на своей поверхности маркеры CD16++ CD 56+. Эти клетки имеют свойства как Т-, так и NK-клеток. Исследование рекомендовано как дополнительный маркер при острых и хронических заболеваниях.
Снижение их в периферической крови может наблюдаться при различных органоспецифических заболеваниях и системных аутоиммунных процессах. Увеличение отмечено при воспалительных заболеваниях разной этиологии, опухолевых процессах.
Исследование ранних и поздних маркеров активации Т-лимфоцитов (CD3+CD25+, CD3-CD56+, CD95, CD8+CD38+) дополнительно назначают для оценки изменений ИС при острых и хронических заболеваниях, для диагностики, прогноза, мониторинга течения заболевания и проводимой терапии.
Т-активированные лимфоциты с фенотипом CD3+CD25+, рецeптор к ИЛ2 CD25+ – маркер ранней активации. О функциональном состоянии Т-лимфоцитов (CD3+) свидетельствует количество экспрессирующих рецепторов к ИЛ2 (CD25+). При гиперактивных синдромах количество этих клеток возрастает (острые и хронические лимфолейкозы, тимома, отторжение трансплантата), кроме того, повышение их может свидетельствовать о ранней стадии воспалительного процесса. В периферической крови их можно выявить в первые три дня болезни. Снижение числа этих клеток может наблюдаться при врожденных иммунодефицитах, аутоиммунных процессах, ВИЧ-инфекции, грибковых и бактериальных инфекциях, ионизирующей радиации, старении, отравлении тяжелыми металлами.
Т-цитотоксические лимфоциты с фенотипом CD8+CD38+ Присутствие CD38+ на ЦТЛ лимфоцитах отмечено у пациентов с разными заболеваниями. Информативный показатель при ВИЧ-инфекции, ожоговой болезни. Увеличение числа ЦТЛ с фенотипом CD8+CD38+ наблюдается при хронических воспалительных процессах, онкологических и некоторых эндокринных заболеваниях. При проведении терапии показатель снижается.
Субпопуляция натуральных киллеров с фенотипом CD3- CD56+ Молекула CD56 – адгезивная молекула, широко представленная в нервной ткани. Кроме натуральных киллеров, экспрессируется на многих типах клеток, в том число на Т-лимфоцитах.
Увеличение данного показателя свидетельствуют о расширении активности специфического клона клеток киллеров, которые имеют меньшую цитолитическую активность, чем NK-клетки с фенотипом CD3- CD16+. Количество этой популяции возрастает при гематологических опухолях (ЕК-клеточная или Т-клеточная лимфома, плазмоклеточная миелома, апластическая крупноклеточная лимфома), хронических заболеваниях, некоторых вырусных инфекциях.
Снижение отмечается при первичных иммунодефицитах, вирусных инфекциях, системных хронических заболеваниях, стрессе, лечении цитостатиками и кортикостероидами.
Рецептор CD95+ – один из рецепторов апоптоза. Апоптоз – сложный биологический процесс, необходимый для удаления из организма поврежденных, старых и инфицированных клеток. Рецептор CD95 экспрессируется на всех клетках иммунной системы. Он играет важную роль в контроле функционирования иммунной системы, так как является одним из рецепторов апоптоза. Его экспрессия на клетках определяет готовность клеток к апоптозу.
Снижение доли CD95+-лимфоцитов в крови пациентов свидетельствует о нарушении эффективности последнего этапа выбраковки дефектных и инфицированных собственных клеток, что может привести к рецидиву заболевания, хронизации патологического процесса, развитию аутоиммунных заболеваний и повышению вероятности опухолевой трансформации (к примеру, рака шейки матки при папилломотозной инфекции). Определение экспрессии CD95 имеет прогностическое значение при миело- и лимфопролифератиных заболеваниях.
Повышение интенсивности апоптоза наблюдается при вирусных заболеваниях, септических состояниях, при употреблении наркотических средств.
Активированные лимфоциты CD3+CDHLA-DR+, CD8+CD38+, CD3+CD25+, CD95. Тест отражает функциональное состояние Т-лимфоцитов и рекомендован для контроля за течением заболевания и контроля иммунотерапии при воспалительных заболеваниях разной этиологии.
Источник
Один из важнейших компонентов иммунной системы — лимфоциты, они являют собой отдельную группу лейкоцитов. Производит их костный мозг. Основная задача лимфоцитов — распознавание чужеродных антигенов с последующим формированием на него иммунного ответа.
Не случаем, лимфоциты именуют «армией» нашего иммунитета. Как в хоть какой армии выделяются различные группы войск, так и лимфоциты бывают различные. Посреди их Т-лимфоциты, В-лимфоциты, NK-лимфоциты, так именуемые «природные убийцы». Любой из этих типов лимфоцитов играет важную роль в обеспечении иммунной защиты.
Лимфоциты считаются повышенными, если периферическая кровь взрослого содержит выше 18-40% (1,0−4,5×109/л). Что это значит, и какие причины приводят к таким показателям мы постараемся разобраться.
Показатели нормы
Нормальными считаются следующие показатели (в 109/л):
- Для детей от рождения до года – 4 –10,5;
- Для детей от одного года до четырех лет – 2 – 7,8;
- Для детей от четырех до шести лет – 1,5 –7;
- Для детей от шести до десяти лет – 1,6– 6,4;
- Для подростков и молодых людей до 21 года – 1- 4,7;
- Для взрослого человека – 1 – 4,5.
При этом показатели в норме относительного количества лимфоцитов выглядят следующим образом:
- Один год – 61%;
- Четыре года – 50%;
- Шесть лет – 42%;
- Десять лет – 38%;
- Двадцать один год – 34%;
- Для взрослого человека – 34%.
Если в результате лабораторного исследования обнаруживаются лимфоциты выше нормы, это говорит о том что в организме возможны неполадки. Такое состояние называется лимфоцитоз.
Почему повышены лимфоциты в крови у взрослого
Что это значит? Причины повышенных лимфоцитов в крови у женщин и мужчин, могут быть разные, но есть несколько типов заболеваний, которые чаще всего приводят к такому явлению:
- инфекционные заболевания;
- бактериальные инфекции;
- аутоиммунные заболевания;
- возможна острая аллергия, а также анафилактический шок;
- появление и рост злокачественных и доброкачественных опухолей и новообразований;
- особо выраженный лимфоцитоз будет в анализах при заболеваниях, которыми можно болеть один раз (корь, краснуха, ветрянка, мононуклеоз, и.т.д.);
- аутоиммунные процессы.
Для определения причины повышения лимфоцитов в крови у взрослого и выбора верной методики, необходимо определить количество форм. В связи с этим, лимфоцитоз, в зависимости от формы его проявления, бывает двух видов:
- Относительный лимфоцитоз – изменяется удельный вес лейкоцитов в структуре лейкоцитарной формулы: не меняя абсолютного значения в крови, они «вытесняют» другие клетки, например, нейтрофилы.
- Абсолютный лимфоцитоз – общее количество иммунных стражей организма резко возрастает как ответ на заболевание или патологию..
Провоцировать повышение лимфоцитов у взрослого человека при относительном лимфоцитозе могут:
- Острые вирусные инфекции.
- Заболевания ревматического происхождения.
- Повышение функции щитовидной железы.
- Спленомегалия.
Чаще всего повышение лимфоцитов у взрослых при абсолютном лимфоцитозе провоцируют:
- Бронхиальная астма.
- Лучевая болезнь.
- Коклюш и туберкулез.
- После удаления селезенки.
- Лимфолейкоз хронической формы.
Помимо разного рода инфекционных и воспалительных заболеваний, способных спровоцировать увеличение лимфоцитов в крови, есть ряд внешних факторов, которые могут вызвать лимфоцитоз:
- Перенесенное хирургическое вмешательство – в постоперационный период всегда имеет место увеличение количества лимфоцитов.
- Неврастения, прием некоторых лекарств – обычно уровень лимфоцитов приходит в норму вскоре после того, как была устранена причина его возникновения.
- Голодание, неполноценное питание – эти факторы способны провоцировать послабление иммунной системы организма.
Дополнительно следует сказать, что сами по себе повышенные лимфоциты в крови еще не выступают в роли какого-либо серьезного лабораторного признака. Особенно это верно тогда, когда их причина связана с воспалительной или инфекционной патологией. Кроме того, даже если уровень лимфоцитов снизился во время лечения, также нельзя говорить, что наступило выздоровление.
Кроме того, повышенные лимфоциты при изучении крови могут представлять собой серьезный диагностический признак при условии, что заметны серьезные изменения в общем в лейкоцитарной формуле. В целом же найти настоящую причину повышенных лимфоцитов обычно оказывается очень непросто. И здесь нужны, в том числе инструментальные методы диагностики, а не только лабораторные.
Лимфоциты выше нормы у детей
У детей 4-5 дня и 4-5 года жизни в крови отмечается физиологический лимфоцитоз, не требующий лечения. Состояние ребенка при этом остается совершенно нормальным, лимфатические узлы не увеличиваются. Такая ситуация обусловлена перестройкой кроветворной системы ребенка.
Тем не менее, повышенное количество лимфоцитов у детей может быть вызвано:
- Лейкемией;
- Бронхиальной астмой;
- Инфекцией: грипп, ОРВИ, ангина и прочие;
- Гнойно-воспалительными процессами;
- Вирусным заболеванием: лишай, коклюш, малярия, ветряная оспа (ветрянка), корь, вирусный гепатит и другие.
Повышены лимфоциты могут быть и при протекании других заболеваний, при различных индивидуальных особенностях организма. Точные причины можно определить только после проведения полного обследования.
Что делать, когда в анализе крови высокие лимфоциты
Если лимфоциты повышены, что делать в этом случае? Ответ может быть только один: выявлять и устранять причину этого состояния. Когда лимфоциты повышены, лечение должно быть направлено не на снижение их уровня, а на саму болезнь.
В зависимости от заболевания терапия занимает от нескольких дней до нескольких месяцев и обычно способствует стабилизации уровня лимфоцитов. К примеру, при большинстве инфекционных процессов назначаются противовоспалительные, жаропонижающие, противовирусные препараты, а также антибиотики. Курс лечения миеломы и лейкоза весьма своеобразен и нередко требует химиотерапии и трансплантации костного мозга.
Источник