Иммуногистохимическое исследование лимфоузлов что это

Иммуногистохимия, или иммуногистохимический анализ — исследование, во время которого в образцах ткани с помощью антител выявляют определенные молекулы. Этот метод диагностики нашел широкое применение в онкологии.

Немного теории и истории. Для того чтобы обнаруживать и уничтожать чужеродные вещества, иммунная система использует особые молекулы — антитела. Они отличаются специфичностью: каждое антитело может связываться строго с определенным антигеном.

В 1941 году американский иммунолог Альберт Кунс впервые решил использовать антитела в лаборатории, чтобы «распознавать» с помощью них белки бактерий. В 1984 году биохимик из Аргентины Сезар Мильштейн получил Нобелевскую премию за то, что создал гибрид опухолевой клетки с лимфоцитом, которая могла синтезировать моноклональные антитела. После этого началось производство моноклональных антител для диагностических и лечебных целей.

В 1994 г. С. Тэйлор применил иммуногистохимический анализ, чтобы проверить 20 000 опухолей, и обнаружил, что диагнозы в половине случаев были ошибочными. Иммуногистохимия зарекомендовала себя как эффективный метод диагностики.

Какие задачи в онкологии помогает решать иммуногистохимия?

Иммуногистохимический анализ помогает врачам-онкологам:

Отнести злокачественную опухоль к тому или иному типу.
Выяснить, в каких генах опухолевых клеток произошли мутации, какие белки способствуют прогрессированию рака.
Выявить первичную опухоль и ее метастазы.
Определить, произошла ли злокачественная трансформация клеток.
Определить прогноз для пациента.
Разобраться, поможет ли в данном случае таргетная терапия.
Определить, чувствительны ли опухолевые клетки к химиотерапии, лучевой терапии.

Как это работает?

Иммуногистохимия бывает прямой и непрямой. В первом случае используют один вид антител, которые должны вступить в связь с определенной молекулой-мишенью. Если молекула-мишень присутствует в ткани, и реакция произошла, опухолевая ткань окрашивается:

Чаще всего к антителу присоединяют фермент, например, пероксидазу. Этот фермент катализирует химическую реакцию, которая приводит к изменению цвета.
Иногда к антителу присоединяют флюоресцин или родамин, при этом окрашивание выявляют с помощью флюоресцентной микроскопии.
всего применяют непрямую иммуногистохимию. При этом используют два антитела. Одно соединяется с антигеном, второе — с полученным комплексом антиген-антитело. Маркер, который вызовет изменение цвета, связывают со вторым антителом.

Непрямой метод имеет некоторые преимущества:

Он обладает более высокой чувствительностью, потому что с одним первичным антителом (тем, которое связывается с белком-мишенью) может связаться несколько вторичных антител.
Исследование занимает немного времени: для того, чтобы произошла реакция, нужно примерно 3 часа.
Непрямая иммуногистохимия требует небольшого количества антител. Например, вторичное антитело, направленное на иммуноглобулины кролика, будет реагировать на любое первичное антитело «кроличьего» происхождения. Не нужно создавать много разных видов вторичных антител с окрашивающей или флуоресцентной меткой.

Как проводят исследование?

Для того чтобы выполнить иммуногистохимический анализ, нужно получить опухолевую ткань, то есть провести биопсию. В качестве материала можно использовать столбик ткани, полученный во время трепан-биопсии, фрагмент тканей или даже целый орган, удаленный во время операции.

Иммуногистохимическое исследование лимфоузлов что это

Образец ткани фиксируют с помощью формальдегида (иногда используют метанол, ацетон и другие фиксаторы — это зависит от того, какой антиген нужно выявить, и реагирует ли он с теми или иными фиксаторами) и погружают в парафин. Парафинизация помогает законсервировать ткань, сохранить ее структуру на длительное время.

Затем ткань, помещенную в парафин, нарезают с помощью специального инструмента — микротома — на слои толщиной 3–5 мкм. Эти тонкие срезы помещают на стекло, покрытое, специальным клеем.

Некоторые образцы слишком чувствительны к реагентам, которые применяют во время вышеописанной процедуры. Их нельзя помещать в парафин. Такие ткани замораживают жидким азотом. Этим альтернативным методом пользуются редко, только в случае необходимости, так как у заморозки есть некоторые недостатки: она делает изображение под микроскопом не таким четким, требует специальных условий хранения образцов. Фиксацию ткани в таких случаях проводят уже после нанесения на стекло и размораживания, ацетоном или формальдегидом.

После того как срезы нанесены на стекло, из них нужно удалить весь парафин, иначе антитела не прореагируют с антигеном. Эта процедура называется депарафинизацией. Ее проводят с помощью ксилола. Затем выполняют еще некоторые подготовительные процедуры, чтобы антитела могли успешно прореагировать с нужными антигенами, и, наконец, проводят непосредственно иммуногистохимический анализ. Обработанную антителами ткань рассматривают под микроскопом, чтобы проверить, окрасилась ли она.

Какие молекулы-мишени выявляют во время иммуногистохимии?

Количество возможных мишеней измеряется сотнями. Перед исследованием врач должен понимать, что он ищет, и использовать соответствующие антитела. В онкологии мишенями являются опухолевые маркеры — вещества, которые в здоровых клетках отсутствуют вообще или присутствуют в значительно меньшем количестве. Вот некоторые примеры:

Рецепторы к эстрогенам и прогестерону помогают идентифицировать гормонально-позитивный рак молочной железы и разобраться, помогут ли женщине гормональные препараты.
Простатспецифический антиген (ПСА) имеет значение в диагностике рака простаты.
Альфа-фетопротеин — присутствует в гепатоцеллюлярной карциноме (рак печени).
Цитокератины помогают в диагностике рака и некоторых сарком (злокачественных опухолей соединительной ткани).
Фермент CD10 (CALLA) связан с карциномой почек, лимфобластным лейкозом.

Иммуногистохимическое исследование лимфоузлов что это

Какова роль иммуногистохимии в современной онкологии?

Иммуногистохимический анализ помогает изучить характеристики злокачественной опухоли, которые не могут выявить другие методы диагностики. Зачастую это играет важную роль в уточнении диагноза и назначении правильного лечения. Врач может определить, какие комбинации препаратов будут наиболее эффективны для конкретного больного, иными словами, реализуется принцип персонализированного лечения. Зачастую это помогает улучшить результаты, подобрать эффективное лечение для пациентов, которым не помогает стандартная терапия.

Источник

Метод определения
Гистологическое исследование биоптата согласно гистологической классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) с окрашиванием гематоксилином-эозином.
ИГХ-исследование с применением спектра антител (до пяти антител) (пероксидазный и авидин-биотиновый методы).

Исследуемый материал
Смотрите в описании

Комплексное исследование биоптатов при лимфопролиферативных заболеваниях, включающее морфологическое описание и оценку экспрессии спектра опухолевых маркеров, для определения тактики лечения и прогноза.

Лимфомы относят к заболеваниям кроветворной ткани – гемобластозам, среди которых выделяют лейкозы и гематосаркомы. Для лимфом характерно развитие очаговых опухолевых разрастаний из элементов кроветворной ткани без поражения костного мозга (лимфатического узла) на ранних стадиях. Этиология лимфом окончательно не установлена. Риск развития неходжкинских лимфом ассоциируется с инфекционными агентами (вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ), вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), человеческим Т-клеточным лимфотропным вирусом типа I), факторами внешней среды (ионизирующим излучением, пестицидами), первичным и вторичным (ятрогенным) иммунодефицитом, аутоиммунными заболеваниями.

В соответствии с российскими клиническими рекомендациями по диагностике и лечению лимфопролиферативных заболеваний (2013), диагноз устанавливают на основании морфологического исследования биопсийного или операционного материала с помощью гистологических и иммуногистохимических методов. Морфологическое исследование должно выполняться патологом-экспертом и соответствовать критериям текущей классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ). Объем иммуногистохимического исследования определяет врач-патологоанатом при гистологическом изучении биоптата. В отдельных случаях проводятся молекулярно-биологическое и генетическое исследования. Цитологическое исследование пунктатов или мазков-отпечатков лимфоузла или других опухолевых очагов не является достаточным основанием для нозологической верификации лимфом.

Пункционная биопсия или трепанобиопсия опухоли с диагностической целью могут быть выполнены только в исключительных случаях при необходимости немедленного лечения.

Дифференциальная диагностика наиболее часто встречающихся лимфом с учетом классификации ВОЗ (2008) и российских клинических рекомендаций по диагностике и лечению лимфопролиферативных заболеваний (2013).

1. Лимфома Ходжкина

Заболеваемость лимфомой Ходжкина (ЛХ) в России составляет 2,1 случая на 100 тысяч населения в год. Заболевание возникает в любом возрасте, но преимущественно в интервале 16-35 лет, в этой возрастной группе в России преобладают женщины. Критерии диагноза: все варианты классической ЛХ характеризуются единым иммунофенотипом: CD30+, CD15+, PAX-5+. В опухолевых клетках может обнаруживаться вирус Эпштейна-Барр (LMP1/EBER).

2. Фолликулярная лимфома

Фолликулярная лимфома (ФЛ) занимает второе место по частоте всех злокачественных лимфопролиферативных заболеваний взрослых. Этот показатель значительно варьирует в разных географических регионах, зависит от этнической и расовой принадлежности больных. Медиана возраста пациентов составляет 60 лет, соотношение мужчин и женщин приблизительно 1:1,7. Иммунофенотип: В-клеточная лимфома с иммунофенотипом CD20+, CD10+/-, BCL-2+, BCL-6+, CD3-, CD5-, CD23+/-, CD43-, сyclin D1-. В редких случаях ФЛ может быть BCL-2-негативная. В таком случае рекомендовано цитогенетическое исследование для выявления t(14;18) или реаранжировки BCL-2. Пролиферативный индекс обычно не превышает 20%, Ki-67 > 30% ассоциируется с неблагоприятным прогнозом.

3. Лимфома маргинальной зоны

Лимфомы маргинальной зоны (ЛМЗ) представляют собой группу злокачественных В-клеточных новообразований, происходящих из В-лимфоцитов, которые в норме встречаются в маргинальной зоне в фолликулах лимфатических узлов (ЛУ), селезенки и лимфатических тканей. Выделяют три типа ЛМЗ:

нодальную лимфому;
экстранодальную MALT (Mucosa-Associated Lymphoid Tissue – мукозоассоциированную) лимфому;
лимфому селезенки.

Наиболее часто при экстранодальных MALT-лимфомах поражается желудочно-кишечный тракт (около 50% случаев). Среди органов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) на долю MALT-лимфомы желудка приходится до 80% случаев. Существует доказанная связь между инфицированностью Helicobacter pylori и MALT-лимфомой желудка, Borrelia burgdorferi и ЛМЗ кожи, Chlamydophila psittaci и ЛМЗ орбиты, Campylobacter jejuni и IPSID (Immunoproliferative Small Intestine Disease – иммунопролиферативным заболеванием тонкой кишки), вирусом гепатита С и ЛМЗ селезенки и негастральными MALT-лимфомами. Иммунофенотип: иммунофенотип нодальных и экстранодальных В-клеточных лимфом из клеток маргинальной зоны идентичен: CD20+, CD5-, CD10-, CD23-, BCL-2+/-, BCL-6-, MUM 1+. В сложных случаях при преобладании диффузного роста рекомендуется дополнительное исследование экспрессии CD38(-) и CD44(+).

4. Диффузная крупноклеточная

В-клеточная лимфома Диффузная крупноклеточная B-клеточная лимфома (ДВКЛ) является наиболее распространенным вариантом лимфом взрослых (30% от всех неходжкинских лимфом). Заболеваемость составляет 4-5 случаев на 100 тысяч населения в год. Риск развития болезни увеличивается с возрастом (медиана заболеваемости – 63 года). Мужчины и женщины болеют почти с равной частотой. Иммунофенотип: экспрессия пан-В-клеточных антигенов CD20+, CD79a+, PAX 5+, CD45+, CD3-. ДВКЛ, как правило, характеризуется высокой митотической и пролиферативной активностью. Ki-67 экспрессируется в широком диапазоне: от 40 до 90%, в отдельных наблюдениях превышает 90%. При наличии технической возможности в алгоритм диагностики может включаться генетическое исследование с определением наличия перестройки генов MYC (до 10% случаев), BCL-6 (до 30% случаев), t(14;18)(q32;q21).

5. Лимфома из клеток мантии

Лимфома из клеток мантии (ЛКМ) составляет около 6% от числа лимфатических опухолей. Болеют преимущественно пожилые мужчины (медиана заболеваемости – 65-75 лет, соотношение мужчин и женщин – 3:1). Опухоль клинически и морфологически гетерогенна, в большинстве случаев (70-80%) в дебюте выявляется генерализованное поражение ЛУ, селезенки и экстранодальных областей. Это агрессивная лимфома, при которой общая выживаемость больных составляет 3-5 лет. Заболевание характеризуется коротким временем до прогрессирования, первый рецидив обычно химиорезистентен. Иммунофенотип: CD20+, CD5+/CD43+, сyclin D1+, BCL-2+, CD3-, CD23- (редкие случаи ЛКМ могут экспрессировать CD10, CD23, BCL-6). Индекс пролиферации менее 30%, как правило, ассоциируется с благоприятным течением заболевания, при бластоидном варианте он может достигать 80-90%. В сложных диагностических случаях целесообразно выполнение цитогенетического/FISH-исследования для выявления t(11;14). В редких случаях при типичной клинической и иммуноморфологической картине отсутствуют t(11;14)(q13;q32) и гиперэкспрессия сyclin D1, имеется гиперэкспрессия cyclin D2 или cyclin D3. В случаях cyclin D1-негативных лимфом из клеток мантии можно дополнительно использовать антитела к p27.

6. Нодальные Т-клеточные лимфомы

Редкая группа заболеваний, которая характеризуется патобиологической гетерогенностью и составляет около 15% от всех лимфом. Вне зависимости от особенностей своего развития и течения, за редким исключением, это агрессивные лимфомы с плохим прогнозом. Наиболее распространенные формы: – периферическая Т-клеточная лимфома. Иммунофенотип: CD2+, CD3+, CD4+, CD5+, CD7+, CD8+, с признаками аберрантности иммунофенотипа (утратой некоторых из них), часть клеток может экспрессировать CD30. – ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома. Иммунофенотип: опухолевые клетки экспрессируют пан-Т-клеточные маркеры, CD4+ преобладают над CD8+. Возможна утрата какого-либо из пан-Т-клеточных антигенов как проявление аберрантного фенотипа. Вариабельное количество опухолевых Т-клеток экспрессирует CD10, BCL6. Наиболее специфичным, но менее чувствительным маркером для данного варианта лимфомы является наличие антител к CXCL13. – анапластическая крупноклеточная лимфома (АККЛ). Иммунофенотип: ключевым иммунофенотипическим признаком является экспрессия CD30 и полиморфная/анаплазированная морфология. Опухолевые клетки имеют аберрантный фенотип с утратой некоторых Т-клеточных антигенов. В части случаев не удается доказать Т-клеточный иммунофенотип (так называемые 0-клеточные АККЛ). Часто обнаруживается экспрессия цитотоксических молекул (TIA-1, granzyme В, perforin). Экспрессия CD45 и EMA вариабельна.

7. Хронический лимфолейкоз

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) – самый частый вид лейкозов у взрослых. Частота его в европейских странах составляет 4:100 тысяч населения в год и непосредственно связана с возрастом. У лиц старше 80 лет она составляет более 30:100 тысяч человек в год. Медиана возраста на момент установления диагноза в европейских странах – 69 лет. В России ХЛЛ выявляется реже и медиана возраста на момент установления диагноза меньше, соразмерно меньшей продолжительности жизни россиян. Иммунофенотип: ХЛЛ характеризуется гетерогенной экспрессией CD20, коэкспрессией CD5, CD23, CD43.

Материал для исследования: биоптат опухоли, фиксированный в парафиновом блоке .

Литература

Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2007 г. Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. 2009;20(3):8-138.
Научная библиотека диссертаций и авторефератов disserCat https://www.dissercat.com/content/morfologicheskaya-i-immunogistokhimicheskaya-differentsialnaya-diagnostika-limfomy-khodzhkin#ixzz41vK9JJCf.
Росcийские клинические рекомендации по диагностике и лечению лимфопролиферативных заболеваний. Под руководством профессора И.В. Поддубной, профессора В.Г. Савченко. – М.: Изд. «Медиа Медика».2013. https://npngo.ru/Attachments/SiteContent/Recomendacii.pdf.
Behringer K., Thielen I., Mueller H. et al. Fertility and gonadal function in female survivors after treatment of early unfavorable Hodgkin lymphoma (HL) within the German Hodgkin Study Group HD14 trial. Annals of Oncology. 2012;23(7):1818-1825.
Buske C., Hoster E., Dreyling M. et al. The Follicular Lymphoma International Prognostic Index (FLIPI) separates high risk from intermediate or low risk patients with advanced stage follicular lymphoma treated front-line with Rituximab and the combination of Cyclophosphamide, Doxorubicin, Vincristine and Prednisone (R-CHOP) with respect to treatment outcome. Blood. 2006;108:1504-1508.
Engert A., Haverkamp H., Kobe C. et al. Reduced-intensity chemotherapy and PET-guided radiotherapy in patients with advanced stage Hodgkin’s lymphoma (HD15 trial): a randomised, open-label, phase 3 non-inferiority trial. Lancet. 2012;379(9828):1791-1799.
Engert A., Plutschow A., Eich H.T. et al. Reduced treatment intensity in patients with early-stage Hodgkin’s lymphoma. New England Journal of Medicine. 2010;363:640-642.
Federico M., Bellei M., Marcheselli L. et al. Follicular lymphoma international prognostic index 2: a new prognostic index for follicular lymphoma developed by the international follicular lymphoma prognostic factor project. Journal of Clinical Oncology. 2009;27:4555-4652.
Harris N.L., Stein H., Sarah E. et al. New approaches to lymphoma diagnosis. Hematology. 2001:194-220.
Meyer R.M., Gospodarowicz M.K., Connors J.M. et al. ABVD Alone versus Radiation-Based Therapy in Limited-Stage Hodgkin’s Lymphoma. New England Journal of Medicine. 2012;366:399-408.
Nogova L., Reineke T., Brillant C. et al. Lymphocyte-predominant and classical Hodgkin’s lymphoma: a comprehensive analysis from the German Hodgkin Study Group. Journal of Clinical Oncology. 2008;26:434-439.

Источник

Код 29.30.
Биопс. материал

Иммуногистохимическое исследование – это наиболее универсальный метод, используемый для выявления и определения локализации специфических антигенов в исследуемых клетках и тканях с помощью антител. Метод широко используется в онкологии для установки окончательного диагноза и для подбора терапии.

Приём, исследование биоматериала
Показания к назначению
Описание

Приём и исследование биоматериала

Приём материала

Можно сдать в отделении Гемотест
Можно сдать анализ дома

Метод исследования

Морфологический

Когда нужно сдавать анализ Иммуногистохимическое исследование лимфатических узлов?

Патологические изменения лимфатических узлов: увеличение размеров, изменение формы, консистенции (уплотнение), появление болезненности.
Системные заболевания соединительной ткани, протекающее с вышеперечисленными изменениями в лимфатических узлах.
Лимфропролиферативные заболевания.
Онкологические заболевания

Подробное описание исследования

Основной функцией лимфатических узлов является защитная. Лимфоузлы – это дренажная система организма, через которую протекает лимфа, поступающая от всех органов и тканей. Они являются своеобразными биологическими фильтрами. С током лимфы в лимфоузлы попадают и задерживаются в них микробные тела, чужеродные антигены и опухолевые клетки. Это приводит к увеличению размера узлов, изменению их формы, консистенции, подвижности, появлению болезненности при пальпации. Изменения лимфатических узлов, не доступных пальпации, можно обнаружить с помощью рентгенологических методов. Увеличение лимфатических узлов наблюдается при специфических и неспецифических инфекционных заболеваниях, системных процессах в соединительной ткани, при приеме различных лекарственных препаратов, при онкологических заболеваниях, характерно для гемобластозов (злокачественные заболевания крови) и особенно для лимфопролиферативных процессов. Первыми при злокачественных заболеваниях поражаются регионарные лимфатические узлы – узлы, находящихся на пути оттока лимфы из пораженного органа.

Для идентификации патологического процесса необходимо гистологическое исследование – изучение ткани под микроскопом. Забор тканей для исследования проводится во время биопсии или оперативного вмешательства. Ткань для исследования необходимо подготовить. Наиболее распространенным методом является фиксация полученных образцов в формалине, в дальнейшем производится обезвоживание биоматериала (проводка) и залитие его парафином. Таким образом, материал «застывает» в виде парафинового блока, который может храниться долгое время. Для гистологического исследования из парафиновых блоков готовятся тонкие срезы, каждый срез наносится на предметное стекло, окрашивается специальным красителем и исследуется под микроскопом. Гистологическое исследование является обязательным этапом перед проведением иммуногистохимического исследования (ИГХ).

ИГХ позволяет идентифицировать клетки различных типов опухолей по их уникальным белкам – антигенам и, таким образом, определить их молекулярный подтип. Микросрез препарата лимфоузла обрабатывают раствором специфических антител (иммуногистохимические препараты), которые вступают в реакцию с белками опухоли (антигенами). Прореагировавшие участки излучают свечение различной интенсивности, в результате получается цифровое изображение иммуногистохимической экспрессии, то есть фактически цветовая картинка, идентифицирующая конкретный тип опухоли.

Исследование особенно важно, когда в лимфатическом узле обнаруживают метастатические опухолевые клетки, а происхождение первичной опухоли неизвестно, то есть первичная опухоль не обнаружена.

С помощью ИГХ можно оценить молекулярный подтип опухоли, определить пролиферативную активность (скорость роста опухоли), при исследовании метастазов установить их источник, определить чувствительность опухоли к конкретной терапии, оценить ее эффективность и определить прогноз течения заболевания.

Помимо определения опухолевых процессов, распознавания вирусов и бактерий, с помощью иммуногистохимического исследования проводится идентификация системных заболеваний соединительной ткани.

Что ещё назначают с этим исследованием?

Использованная литература

Gremel G et al, 2014. A systematic analysis of commonly used antibodies in cancer diagnostics. Histopathology. PubMed: 24330150 DOI: 10.1111/his.12255
Лифшиц В.М., Сидельникова В.И. Медицинские лабораторные анализы. – Москва: Триада Х, 2007.- с.199-212.
Российские клинические рекомендации по диагностике и лечению лимфопролиферативных заболеваний, 2018

Интерпретация результата

В зависимости от ответа на специфические антитела выстраивается картина молекулярного подтипа различных типов опухолей.

При диагностике вирусной и бактериальной инфекции – возбудитель определяется на этапе гистологического исследования образца.

Источник