Что такое пролиферация лимфоцитов
Лимфоцитарная пролиферация злокачественных лимфом кожи.Распределение лимфоцитов в коже в зависимости от фенотипа, которое наблюдается в физиологических условиях, находит отражение в развитии лимфопролиферативных заболеваний: Т-лимфопролиферативные опухоли развиваются обычно в верхних слоях дермы и для них характерен экзоцитоз лимфоцитов в эпидермис вплоть до образования внутриэпидермальных микроабсцессов из Т-лимфоцитов (эпидермотропизм). В-лимфопролиферативные процессы возникают в глубоких слоях дермы и обычно не носят эпидермотропный характер. Эти опухоли значительно чаще бывают при системных лимфопролиферативных процессах. В группе злокачественных лимфом кожи удельный вес заболеваний, в основе которых лежит Т-лимфоцитарная пролиферация, значительно превосходит удельный вес В-лимфом, что отражает реальное соотношение Т- и В-лимфоцитов в нормальной коже. Поданным G. Burg, Т-лимфомы кожи составляют приблизительно 65% всех вариантов ЗЛК, В-лимфомы кожи — 25%, 10% приходится на неклассифицируемые лимфомы. В нормальной коже лимфоциты в периваскулярных областях представлены почти одинаковым количеством хелперов и супрессоров, хелперносупрессорный индекс обычно равен 0,93—0,96. Встречается также определенное количество клеток, обладающих киллерной активностью (натуральные киллеры).
Т-клеточные лимфомы обычно протекают с преимущественной пролиферацией лимфоцитов, имеющих хелперный фенотип, гораздо реже пролиферируют клетки с супрессорным или киллерным фенотипом. Преобладание пролиферации Т-лимфоцитов с фенотипом Т-хелперов у больных ЗЛК, возможно, связано с тропностью вирусов типа HTVL-1 к субпопуляции Т-хелперов и способностью этих вирусов к длительной персистенции в таких клетках. Известно, что большая часть Т-лимфом кожи, в том числе наиболее распространенное заболевание этой группы — грибовидный микоз и его лейкемический вариант — синдром Сезари, протекают с преимущественной пролиферацией Т-хелперов, в частности Т2-хелперов-клеток памяти. Сопоставление клинического течения злокачественных лимфом кожи с принадлежностью клона пролиферирующих злокачественных клеток к определенной субпопуляции Т-лимфоцитов показало, что тяжесть течения заболевания не определяется происхождением злокачественного клона из Т-хелперов, супрессоров или киллеров. Следует учитывать, что фенотип пролиферирующих клеток может меняться. Описаны случаи развития Т-клеточной лимфомы (грибовидного микоза) через год после появления клинически типичной и подтвержденной фе-нотипически В-клеточной лимфомы. Злокачественная Т-лимфома кожи может также предшествовать развитию В-клеточной лимфомы, что объясняют рядом причин: мутагенным действием полихимиотерапии, стимуляцией В-лимфоцитов патологическим клоном Т-лимфоцитов и др. Известны случаи сочетания Т- и В-лимфомы у одного больного, когда поражение кожи протекало по типу Т-лимфопролиферативного процесса, а в периферической крови и регионарных лимфатических узлах обнаруживали атипичные В-лимфоциты. В процессе развития опухоли лимфопролиферативного характера происходит изменение характера экспрессии обычных антигенов лимфоцитами, потеря некоторых из них и появление дополнительных маркеров, подтверждающих злокачественность клональных пролиферирующих лимфоцитов. При этом происходят следующие иммунофенотипические изменения клеток появление клеток с аберрантным фенотипом (когда на атипичных лимфоцитах определяются маркеры как Т-, так и В-лимфоци-тов или маркеры Т-хелперного и Т-супрессор-ного фенотипа одновременно), а также лимфоцитов, имеющих маркеры незрелых клеток или характеризующихся потерей одного или нескольких панантигеноь. Кроме того, пролиферация клеток сопровождается повышенной экспрессией некоторых других антигенов, в частности антигена ядер пролиферирующих клеток – Ki-67. Наличие большого количества лимфоцитов с указанными имму-нофенотипическими признаками в клеточном составе пролиферата очагов поражения кожи, крови, лимфатических узлах и внутренних органах (при метастазировании) обычно является признаком тяжелого клинического течения процесса и плохого прогноза. С развитием молекулярной иммунологии и иммуногенетики появились новые методы, позволяющие с высокой чувствительностью определять клетки злокачественного клона лимфоцитов по маркерам, отражающим перегруппировки или поломки на уровне генных структур клеток (генотипирование клеток). Так, с помощью методов блот-гибридизации по Southern и ПЦР у больных различными клиническими формами ЗЛК удается определять злокачественные клетки, экспрессирующие онкобелки семейства с-тус и c-ras, отражающие нарушение функционирования генов, ответственных за пролиферацию клеток. Кроме того, с помощью ПЦР удается обнаруживать лимфоциты с переустройством структуры Т-клеточного рецептора (TCR), что маркирует перегруппировку гена Т-клеточного рецептора и является признаком злокачественности Т-лимфоцитов. При этом могут определяться изменения структуры как фиксированных цепей TCR (аи(3), так и вариабельных частей этих рецепторов (TCR-V). Атипичные лимфоциты с перегруппировкой TCR обнаруживают у больных ЗЛК в крови, лимфатических узлах, пораженной коже уже на ранних стадиях заболевания. Значительно чаще определяются лимфоциты с маркерами, отражающими перегруппировку а- и [3- цепей TCR, что обычно сочетается с наличием налим-фоцитах маркеров CD4H и CD45RO+. Гораздо реже встречаются варианты атипичных лимфоцитов с маркерами переустройства у- и 8-цепей TCR (так называемые у-5-Т-клеточные лимфомы). Экспрессия у, 8-рецепторов TCR чаще сочетается с экспрессией CD4+, реже CD8+ маркеров, однако в редких случаях оба эти рецептора (CD4 и CD8) могут не экспрессироваться. Обычно лимфоциты с у- 5-рецепторным комплексом не проявляют тропности к эпидермису. Кожные Т-лимфомы, в основе развития которых лежит пролиферация лимфоцитов с переустройством у- и 5-цепей TCR, обычно характеризуются агрессивным клиническим течением опухолей и плохим прогнозом. При ВЗЛК генотипический анализ выявляет в злокачественных В-лимфоцитах перестройки в генах, кодирующих тяжелые цепи иммуноглобулинов, что также является признаком злокачественности таких клеток. – Также рекомендуем “Роль нарушения апоптоза в развитии злокачественных лимфом кожи.” Оглавление темы “Злокачественные лимфомы кожи.”: |
Источник
Пролиферация Т-лимфоцитов является достаточно хорошо изученным процессом, который происходит в вилочковой железе человека. Он включается в себя такие этапы:
- Дифференциация тимоцитов осуществляется из общей для всех клетки-предшественницы. Эта клетка развивается вне тимуса и способствует экспрессии таких мембранных белков, как CD2, CD3 и CD7.
- Миграция клетки-предшественницы, готовой к дифференцировке, в тимоциты, в подкапсулярную зону вилочковой железы. После этого в течение недели в подкапсулярной зоне происходит пролиферация Т-лимфоцитов. В результате этого на тимоцитах формируются новые мембранные белки CD25 и CD44.
- Перемещение сформировавшихся тимоцитов в глубину коры тимуса. При этом молекулы CD44 и CD25 уходят с мембраны иммунокомпетентных клеток. На данной стадии пролиферация Т-лимфоцитов включает перестройку цепей TCR. На этой стадии происходит накопление большого количества иммунных клеток с готовой цепью В, но без перестроенных генов а-цепи.
- Перестройка Va-генов происходит 1-2 раза в течение нескольких суток. При этом перестроение генов а-цепей становится причиной необратимой делеции локусов b, которые находятся между фрагментами а-цепи.
- Экспрессия TCR регулярно осуществляется в каждой новой а-цепи и обеспечивает дальнейшую дифференцировку Т-лимфоцитов.
- Позитивный селективный отбор тимоцитов, которые связываются с комплексом «пептид—МНС». Этот процесс, без которого невозможна пролиферация Т-лимфоцитов, происходит на мембране эпителиальных клеток в вилочковой железе. Вследствие такой позитивной селекции в тимусе гибнет большая часть тимоцитов, а остальные продолжают процесс дифференцировки.
- Негативный селективный отбор способствует уничтожению клонов тимоцитов, которые имеют повышенную аффинность к комплексам «пептид—МНС». В результате негативной селекции удается элиминировать более 50% иммунных клеток, которые прошли позитивный этап селекции.
- Тимоциты, которые связались комплексом «пептид-МНС» с нормальным уровнем аффинности, выживают и проходят в следующий этап дифференцировки.
- Завершающий этап, которым заканчивается пролиферация Т-лимфоцитов. В результате этого процесса формируется два основных типа Т-лимфоцитов — Т8 (CD8) и Т4 (CD4). Лимфоциты CD8 выполняют функцию Т-киллеров, которые занимаются непосредственно уничтожением клеток, у которых на мембране имеется чужеродный антиген. Лимфоциты CD4 имеют более разностороннее функциональное предназначение. В процессе пролиферации Т-лимфоцитов эти иммуннокомпетентные клетки выполняют функцию Т-хелперов. Их задача заключается в выработке цитокинов, которые способствуют поступлению Т-киллеров к чужеродным антигенам с последующим их уничтожением.
Патологические состояния, связанные с нарушением пролиферации Т-лимфоцитов
Если пролиферация Т-лимфоцитов по какой-то причине нарушилась, то возникает недостаточность Т-клеточного иммунитета. Это приводит к патологической восприимчивости тканей организма к негативному влиянию бактерий, грибов и вирусов. Например, пролиферация Т-лимфоцитов может наблюдаться при синдромах Незелофа и Ди-Джорджи, которые сопровождаются недоразвитием тимуса. У пациентов, имеющих эти патологические состояния, практически отсутствуют реакции со стороны Т-клеток. Что касается гуморального иммунитета, то он также существенно нарушен. Патология клеточного иммунитета может отмечаться у людей, страдающих синдромом Вискотта-Олдрича или Луи-Бара. При синдроме Вискотта-Олдрича у больных, помимо восприимчивости к различным инфекциям, отмечается снижение уровня тромбоцитов и формирование экземы. Синдром Луи-Бара характеризуется появлением на коже телеангиоэктазий и атаксией. Кроме того, ученые выявляли синдром дисфункции Т-клеточного иммунитета, связанный с наличием в сыворотке пациента цитотоксических антител против Т-лимфоцитов.
Источник
- Иммунология и аллергология
- Иммунология
- Иммунология : практикум : учеб, пособие
Лимфоциты — единственный тип клеток крови, для которых пролиферация в периферических тканях является физиологической нормой и обязательным этапом в развитии иммунного ответа. Поэтому количественная оценка пролиферативной активности лимфоцитов в спланированных экспериментальных условиях может служить мерой реактивности лимфоцитов на тот или иной внешний стимул. Если такой внешний стимул — специфический антиген, то уровень пролиферативного ответа лимфоцитов допустимо расценить как показатель иммуногенности препарата, содержащего антиген (способности вызывать на себя иммунный ответ), или численности клона(ов), реагирующих на данный антиген лимфоцитов.
Существуют вещества, которые называют митогенами за их способность вызывать деление клеток. Митогены обусловливают поликлональную или олигоклональную пролиферацию лимфоцитов. Первым случайно обнаруженным в процессе рутинных работ в банке крови по гемагглютинации эритроцитов митогеном лимфоцитов стал лектин фитогемагглютинин (ФГА) из обыкновенной фасоли Phaseolus vulgaris, способный агглютинировать эритроциты только определенного серологического типа. ФГА — сильный мито- ген, индуцирующий переход клеток из стадии G2 в митоз. Впервые ФГА выделен из фасоли П. Новеллом в 1960 г. С тех пор появился новый метод оценки пролиферативной активности лимфоцитов человека и экспериментальных жиротных, получивший название бласттрансформация. Оказалось, ФГА вызывает митотическое деление преимущественно Т-лимфоцитов. Также преимущественное митогенное действие в отношении Т-лимфоцитов оказывает лектин конканавалин А, выделенный из растений семейства бобовых
Canavalia ensiforme. В последнее время получили широкое распространение моноклональные антитела (монАТ) против CD3 или CD28 антигенов (как наиболее мощные поликлональные стимуляторы Т-лимфоцитов).
Митоген (pokeweed mitogen) из корня растения лаконоса Phytolacca americana стимулирует пролиферацию и В- и Т-лимфоцитов, а кроме того вызывает поликлональную продукцию иммуноглобулинов В-лимфоцитами. Пролиферацию преимущественно В-лимфоцитов вызывают препараты липополисахаридов (ЛПС) эндотоксинов из грамотрицательных бактерий.
Методы оценки пролиферативной активности лимфоцитов в культуре in vitro рассчитаны на выявление и измерение уникального для клеточного деления процесса — удвоения ДНК в S-фазе митоза.
Методов существует несколько.
- Исторически первый метод — микроскопический (морфологический). Клетки, прошедшие S-фазу, но еще не прошедшие митоз, имеют двойное количество ДНК и остальных компонентов хромосом. Соответственно вся клетка больше по размеру, чем неделя- щиеся клетки, что хорошо видно на препаратах мазков или даже в живой культуре под световым микроскопом. Микроскопический метод детекции клеток в S-фазе называют «реакцией бласттранс- формации» и в настоящее время используют по крайней мере для демонстрации бластных и других форм лимфоцитов. Помимо поликлональной активации Т- и В-лимфоцитов, достаточно широко используются методы, основанные на стимуляции антиген/аллерген- специфических клонов Т- и В-клеток. Естественно, что в последнем случае число трансформированных клеток может быть мало. Для их подсчета морфологический метод не пригоден.
В лабораторной генетике реакцию бласттрансформации лимфоцитов применяют с целью визуализации хромосом и анализа кариотипа человека. Для остановки клеточного цикла на стадии митоза используют колхицин.
- Колорометрический метод. Он основан на использовании внутриклеточных прижизненных красителей, включаемых в цепи ДНК. Это, например, МТТ — 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолиум бромид.
- Микроцитофлуорометрический метод (FACS). Он основан на использовании флюоресцентных красителей, включаемых в цепи ДНК, с оценкой на проточном цитометре.
- Радиоизотопный метод. Он основан на использовании меченых нуклеотидов, включаемых в состав только ДНК, в частности тими- дина (3H-Td) — (3-излучатель, уридина 14C-Td — у-излучатель или 1311-дезоксиуридина — у-излучатель.
«Золотым стандартом» для оценки пролиферации является последний метод — радиоизотопный, поскольку с его помощью подсчитывают не только клетки, находящиеся в данный момент в S-фазе, но и уже поделившиеся дочерние клетки, которые другие названные методы уже «не видят». Опишем кратко метод оценки пролиферации по включению 3Н-тимидина.
- Создают экспериментальную систему стимуляции лимфоцитов in vitro: это может быть внесение антигена, митогена или других стимулирующих агентов (цитокины, антитела против поверхностных антигенов и др.). Время культивирования лимфоцитов зависит от стимулятора: для митогенов — обычно 72 ч, для антигена — до 6— 7 сут.
Б. За 4—24 ч до остановки эксперимента in vitro вводят меченый тимидин. Чаще всего используют метил-3Н-тимидин. Удельная радиоактивность препарата — около 1—2 Кю/мкмоль. Если удельная активность коммерческого препарата выше, то его разводят «холодным» (т.е. нерадиоактивным) тимидином до заданной величины, чтобы избежать «тимидинового самоубийства» живых клеток. Готовят матричный раствор тимидина в культуральной среде: как правило, его концентрация составляет 20 мкКю/мл. Если эксперимент проводят in vitro в лунках с объемом 200 мкл, то в каждую лунку вносят по 25 мкл матричного раствора 3Н-тимидина, что создает его рабочую концентрацию 0,5 мкКю на лунку. Количество клеток в лунке при этом, как правило, составляет 1—5х105.
- По завершении культивирования в присутствии 3Н-тимидина клетки удаляют из лунок прибором харвестером на непроницаемые для клеток микропористые фильтры, геометрически соответствующие формату лунок культуральных плашек. Фильтры промывают от невключившегося в клеточную ДНК 3Н-тимидина, после чего сушат при 60—80 °С под инфракрасной лампой или феном.
Г. Каждый фильтр помещают в индивидуальный флакон с сцин- тилляционной жидкостью и в специальном счетчике (3-частиц просчитывают число импульсов в минуту (срт) и определяют индекс стимуляции. Его значение и является количественным показателем уровня пролиферации исследуемых клеток. Показатели экспериментальных лунок сравнивают с контрольными и рассчитывают статистическую достоверность различий.
Источник: под ред. Л. В. Ковальчука, Г. А. Игнатьевой, Л. В. Ганковской., «Иммунология : практикум : учеб, пособие» 2010
А так же в разделе «ОЦЕНКА ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ »
- ОЦЕНКА КЛЕТОЧНОЙ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ
- Лабораторная работа 3-1
- Определение перфорина методом ELISPOT
- Связывание с тетрамерными структурами МНС класса I
- Определение каспаз методом проточной цитофлуорометрии
- Определение цитотоксической активности NK-клеток
- Лабораторная работа 3-2
- Оценка функциональной активности NK-клеток с использованием проточной цитометрии
- Комплементзависимая цитотоксичность
- ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ФАГОЦИТОВ
- Лабораторная работа 3-3 Определение фагоцитарной активности нейтрофилов и макрофагов
- Лабораторная работа 3-4 Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов человека
- Метод оценки хемотаксиса нейтрофилов с использованием камеры Бойдена
- Особенности постановки методов оценки хемотаксиса in vitro
- Лабораторная работа 3-5 Получение супернатанта, содержащего цитокины и другие биологически активные молекулы из моноцитов периферической крови человека
- Определение выработки активных форм кислорода и оксида азота
- Описание метода люминолзависимой хемилюминесценции
- Определение содержания NO в супернатантах культуры фагоцитов in vitro
- Оценка киллинга фагоцитов
- Определение активности миелопероксидазы в лейкоцитах периферической крови
- Количественная оценка антителообразующих клеток (метод Йерне)
- Постановка реакции выявления АОК (метод Н. Йерне)
Источник