Что такое клональность лимфоцитов

В настоящее время этот тест широко используется для диагностики лимфопролиферативных заболеваний.

Лимфопролиферативные заболевания собак и кошек могут проявляться огромным количеством разнообразных клинических признаков, отражая различную природу клеток, дающих начало этим состояниям. Часто диагноз очевиден, и его можно поставить при цитологическом или гистологическом исследовании ткани, костного мозга или мазка крови. Однако на ранних стадиях лимфомы, когда злокачественные клетки составляют меньшую часть от общей популяции, а также в случаях, когда присутствуют мелкие, выглядящие доброкачественными, лимфоциты, могут потребоваться дополнительные диагностические исследования, чтобы установить окончательный диагноз.

Выявление клональности лимфоцитов (PARR)

Любой диагностический тест, который может показать, что группа клеток происходит от одной клетки, можно рассматривать как тест на клональность. Обычно этот термин используют при обнаружении уникальных генов рецепторов В- или Т-клеток: генов иммуноглобулинов В-клеток и генов Т-клеточного рецептора в Т-клетках. Фрагмент этих генов, кодирующий антиген-связывающий участок, является фрагментом, различающимся по размеру и последовательности у разных лимфоцитов.

По мере созревания и деления B- или T-клеток в ответ на контакт и стимуляцию антигеном, гены иммуноглобулинов и Т-клеточного рецептора передаются дочерним клеткам. В ходе нормального иммунного ответа разные В- и Т-клетки активируются в ответ на контакт с патогеном, каждая из них претерпевает клональную экспансию и затем погибает, оставляя после себя небольшое количество клеток памяти. Неопластической может стать одна единственная клетка, но поскольку ее рост и деление больше не контролируются, она может бесконечно размножаться, не требуя никаких сигналов, в отличии от клеток, размножающихся в процессе иммунного ответа.

Следовательно, если будет установлено, что большая часть клеток среди популяции лимфоцитов обладает одинаковым иммуноглобулиновым или Т-клеточным рецептором, можно заключить, что эти клетки, скорее всего, являются потомками одной единственной клетки, и они также являются злокачественными, а не реактивными. Ряд лабораторий в настоящее время использует этот тест в разных клинических ситуациях.

На практике тест на клональность чаще всего используется для различия реактивных (поликлональных) лимфоцитов от неопластических (моноклональных), если это различие сложно установить другим способом.

Говорит ли выявление клональной популяции о наличии лимфомы или лейкемии?

Поскольку тест на клональность может выявить 1 неопластическую клетку на 100 клеток, он дает возможность обнаружить неопластические лимфоциты раньше, чем цитологическое или гистологическое исследование. Поэтому для определения специфичности положительного (клонального) результата пациенты с положительным результатом, но без гистопатологических или цитологических свидетельств лимфомы должны наблюдаться в течение некоторого периода времени, чтобы понять, действительно ли наличие клональной популяции предсказывает о развитии лимфомы/лейкемии.

В лаборатории Университета Штата Колорадо были получены данные наблюдения за 141 собакой с положительными результатами теста на клональность, но без окончательного цитологического или гистологического диагноза, в течение года. У 6 % этих пациентов так и не появилось дополнительных свидетельств развития лимфомы в течение этого года, у оставшихся 94 % пациентов в течение года был поставлен диагноз лимфома или лейкемия. Единственным не неопластическим заболеванием у собак, при котором может появляться клональная экспансия лимфоцитов, является заражение Ehrlichia, и у 2 собак из 6 % пациентов с ложноположительными результатами серологически была подтверждена инфекция Ehrlichia. В остальных случаях у собак была выявлена ассоциация В-клеточной моноклональной экспании с болезнью Лайма, бартонеллезом и пятнистой лихорадкой Скалистых Гор (но не было получено окончательного доказательства, что именно эти заболевания вызвали клональную экспансию), а оставшиеся случаи были идиопатическими. Эти факты обязательно следует учитывать при назначении теста на клональность и интерпретации результатов этого теста.

Чувствительность данного теста на настоящий момент составляет около 85 % в подтвержденных случаях лимфомы или лейкемии. Ложноотрицательные результаты могут быть получены, поскольку вероятнее всего тест-система не может охватить все разнообразие ДНК генов иммуноглобулинов рецепторов. Также могут быть получены ложноположительные результаты в случаях инфекции, вызванной Ehrlichia canis, при плохом качестве выделенной ДНК.

Обобщая все выше указанное, можно заключить, что тест на клональность чаще всего используют:

А. Для обнаружения лимфопролиферативного заболевания (лимфомы, хронической лимфоидной лейкемии), если результаты цитологического или гистологического исследования не являются однозначными.

Б. Для ретроспективного поиска пренеопластических экспансий лимфоцитов.

В. Для определения природы лимфоцитов при лимфоме (Т- или В-клетки), что более актуально для собак, поскольку часто происхождение клеток влияет на лечение и прогноз для животного.

Тест на клональность не поможет, если нужно:

А. Провести иммунофенотипирование. Такое исследование проводят с помощью проточной цитометрии или иммуногистохимии.

Б. Определить стадию лимфомы.

В. Различить новообразования лимфоидной и миелоидной клеточных линий.

Это исследование нельзя использовать как скрининговый тест у здоровых животных.

16 июля 2015

© ООО Независимая ветеринарная лаборатория ПОИСК

В статье приведены данные об исследованиях, способствующих совершенствованию дифференциальной диагностики Т- и В-клеточных лимфом кожи, в том числе с крупнобляшечным парапсориазом, Т- и В-клеточными псевдолимфомами кожи, а также о частоте их трансформации в злокачественные лимфомы кожи. У 101 пациента проведено обследование методом полимеразной цепной реакции с целью определения Т- и В-клеточной клональности лимфоцитов по генам g- и β-цепей Т-клеточного рецептора и генам тяжелой цепи иммуноглобулина. У пациентов с Т-клеточными лимфомами кожи моноклональность определялась в 40 из 46 случаев, с В-клеточными лимфомами кожи — в 3 из 4 случаев. Также моноклональность была выявлена в 1 из 14 случаев крупнобляшечного парапсориазам и в 1 из 2 случаев Т-клеточной псевдолимфомы кожи. Во всех 24 случаях хронических доброкачественных дерматозов, 5 случаях мелкобляшечного парапсориаза и 10 биоптатах кожи от здоровых доноров была выявлена поликлональность лимфоцитов. Таким образом, полученные результаты позволяют считать данный метод важным дополнением в диагностике лимфопролиферативных заболеваний кожи.

Как известно, молекулярно-генетические методы определения клональности лимфоцитов, основанные на применении полимеразной цепной реакции (ПЦ Р), повышают точность выявления злокачественных лимфом кожи (ЗЛК) [1]. Однако используемый ранее полиакриламидный гель-электрофорез был менее информативным при ЗЛК [2, 3] по сравнению с разработанным и используемым в настоящее время методом фрагментного анализа (the automated high-resolution PCR fragment analysis). Высокая чувствительность данного метода основывается на возможности дифференцировать нуклеотидные последовательности с точностью до одного нуклеотида [2].

Метод фрагментного анализа основан на разделении меченных флюоресцентным красителем ПЦР-продуктов в капиллярах, заполненных гелем. Для исследования используется автоматический анализатор нуклеиновых кислот. Флюоресцентный сигнал, испускаемый ПЦР-продуктом, фиксируется в виде пика определенной высоты и площади в зависимости от интенсивности свечения [4].

При ПЦР-анализе исследуется уникальная для каждого Т- и В-лимфоцита область соединения V-D-J сегментов (CDR3 области) генов гамма- и бета-цепей Т-клеточных рецепторов лимфоцитов (TCRγ и TCRβ), а также генов тяжелой цепи иммуноглобулинов (IgH). При появлении клона лимфоцитов, если перестройка прошла на одной хромосоме (моноаллельная перестройка), среди амплификатов будет доминировать один ПЦР-продукт, если перестройка прошла на двух гомологичных хромосомах (биаллельная перестройка) — два ПЦР-продукта [5].

Клональность лимфоцитов определяется при наличии 1—10% опухолевых лимфоцитов в образце, что позволяет выявлять ее не только в биоптатах кожи, но и в образцах крови [6, 7].

Основным показанием к определению клональности Т- и В-лимфоцитов является дифференциальная диагностика опухолевой и реактивной пролиферации лимфоцитов [3, 8]. Определение моноклонального типа пролиферации свидетельствует о злокачественном характере болезни. Однако иногда моноклональность лимфоцитов может выявляться при различных хронических воспалительных дерматозах (ХВД), таких как псориаз, экзема, атопический дерматит [9—11], инфекционных воспалительных процессах (инфекционный мононуклеоз) [12] или системных заболеваниях соединительной ткани (системная склеродермия, системная красная волчанка и т. д.). При этих заболеваниях высота доминирующих пиков, обозначающих клоны лимфоцитов (по данным фореграмм фрагментного анализа), достоверно ниже, чем при ЗЛК [13]. Поликлональный тип пролифераций выявляется при доброкачественных реактивных лимфопролиферативных процессах и ХВД. При ЗЛК, даже подтвержденных гистологически, возможно отсутствие моноклональности лимфоцитов инфильтрата, что связано с неравномерным распределением лимфоцитов в коже. Это, в частности, наблюдается при эритродермии у больных грибовидным микозом, при котором воспалительный компонент доминирует над пролиферативным, а также при незначительном количестве опухолевых лимфоцитов в биоптате коже на начальных стадиях лимфомы кожи [14, 15]. Следует отметить, что моноклональность опухолевых лимфоцитов может иметь место не только в биоптате пораженной кожи, но и в крови этого же пациента в 15% случаев на ранних стадиях и 63% на поздних стадиях грибовидного микоза [16]. При этом эффективность ранней диагностики ЗЛК повышается путем одновременного гистологического и молекулярно-генетического исследования двух биоптатов пораженной кожи в совокупности с образцом крови пациента.

С учетом вышесказанного целью настоящего исследования явилось совершенствование дифференциальной диагностики Т- и В-клеточных лимфом кожи (ТКЛК и ВКЛК) с крупнобляшечным парапсориазом (КБП), Т- и В-клеточными псевдолимфомами (ТПЛК и ВПЛК) кожи, с ХВД, а также уточнение частоты их трансформации в ЗЛК.

Материал и методы

Метод фрагментного анализа для определения клональности лимфоцитов был применен нами при обследовании 101 пациента (66 мужчин и 35 женщин) с патологическим процессом, требующим дифференциальной диагностики с ТКЛК и ВКЛК. Возраст пациентов варьировал от 27 до 87 лет (средний возраст 57 лет). У 46 из них был гистологически установлен диагноз ТКЛК, у 4 — ВКЛК, у 19 — парапсориаз, у 8 — псевдолимфомы кожи. В группу больных с ХВД, схожими по ряду клинических симптомов с ТКЛК, было включено 24 пациента с гистологически установленным диагнозом хронического воспалительного процесса (табл. 1).

Все пациенты были обследованы в отделении дерматоонкологии и дерматовенерологии и отделении патоморфологии ГУ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. Молекулярные методы определения клональности лимфоцитов проводились в лаборатории молекулярной гематологии ГНЦ РАМН. Диагноз лимфомы кожи устанавливали в соответствии с международной классификацией лимфом кожи WHO /EORTC (2005 г.) [17]. Объектом исследования являлись биоптаты пораженной кожи, у 3 больных помимо двух биоптатов исследовали на клональность лимфоцитов образцы периферической крови.

В качестве положительного (моноклонального) контроля использовали клеточную линию Jurkat (линия клеток Т-лимфобластного острого лейкоза), имеющую биаллельную перестройку гамма-цепи Т-клеточного рецептора, которая выявляется с Vγ1—8 и Vγ11 праймерами. В качестве поликлонального контроля использовали мононуклеары периферической крови здоровых доноров и образцы кожи, полученные в ходе пластических операций у здоровых людей.

Выделение ДНК

Мононуклеары из периферической крови выделяли в градиенте плотности фиколла (плотность 1,077 г/см3) стандартным методом. ДНК выделяли из мононуклеаров периферической крови с помощью набора Wizard genomic DNA purification system (Ргоmеgа, США), из свежей или замороженной ткани (кожи и крови) стандартным методом — обработкой протеиназой К с последующей очисткой в феноле и хлороформе и осаждением в трех объемах 96% этилового спирта с раствором аммония ацетата в конечной концентрации 1М. Концентрацию выделенной ДНК проверяли на спектрофотометре Beckman DU-64.

Анализ В-клеточной клональности по генам IgH и Т-клеточной клональности по генам TCRγ и TCRβ

Определение В-клеточной клональности лимфоцитов проводили на основе анализа перестроек вариабельного региона генов тяжелой цепи иммуноглобулина, T-клеточной клональности лимфоцитов — на основе перестроек генов γ- и β-цепи Т-клеточного рецептора. Определение клональности лимфоцитов проводили методом ПЦР и методом фрагментного анализа. Для определения B-клеточной клональности лимфоцитов использовали смесь праймеров к фракциям FR1, FR2, FR3 вариабельного региона генов IgH и меченный флюоресцентной краской консенсусный праймер к J-региону IgH [18].

Для мультиплексной ПЦР-генов TCRγ применяли два набора праймеров: 1) смесь праймеров Tγ [18], 2) смесь праймеров Tγγ [19]. Для мультиплексной ПЦР генов TCR β применяли смесь праймеров Tβ [18]. Все праймеры для определения T-клеточной клональности лимфоцитов — смесь прямых праймеров к V генам TCR и меченных флюоресцентной краской обратных праймеров к J генам TCR. ПЦР проводили на автоматическом термоциклере DNAEngine (BioRad). Реакционная смесь в конечном объеме 20 мкл включала: 200 нг ДНК, 10 мкл 2 X смеси для ПЦР (PCR Master Mix Promega), 5 пмоль каждого праймера. Условия ПЦР: предварительная денатурация 95 °С (5 мин), 35 циклов ПЦР для IgH и TCRγ и 40 циклов для TCRβ — 95 °С (35 с.), 60 °С (35 с.), 72 °С (35 с.), окончательная пролонгация 72 °С (10 мин.). Результаты реакции выявляли в 2% агарозном геле, окрашенном бромидом этидия. При успешной ПЦР проводили очистку ПЦР продуктов и фрагментный анализ.

Очистка ПЦР-продуктов и фрагментный анализ амплификатов

Для очистки ПЦР-продуктов в каждую пробирку добавляли по 100 мкл смеси для осаждения ДНК (0,25
объема 10М раствора ацетата аммония, 2–2,5 объема 96% этилового спирта), инкубировали 20 мин. при комнатной температуре, центрифугировали 20 мин. при 13 000 g. Осадок ДНК дважды отмывался 70% спиртом, высушивался при комнатной температуре, разбавлялся дистиллированной водой 30 мкл. Концентрация очищенных продуктов проверялась в 2% агарозном геле, окрашенном бромидом этидия. В за висимости от интенсивности свечения ПЦР-продукты разводились в 10–40 раз. Разведенные продукты смешивались с формамидом (2 мкл продукта, 10 мкл формамида, 0,05 мкл внутреннего стандарта Genescan 500LIZ (Applied Biosystems). Денатурацию ДНК проводили в растворе с низкой ионной силой. 5 мкл ПЦ Р-продукта разводили в 15 мкл LIS-solution (10% раствор сахарозы + 0,01% бромфеноловый синий), полученную смесь инкубировали в течение 5 мин. при температуре 95 °С, а затем быстро охлаждали во льду до 0 °С в течение 10 мин. Затем 10 мкл денатурированного продукта наносили в плашку автоматического секвенатора. Для фрагментного анализа использовали автоматический анализатор нуклеиновых кислот ABI Prism 3130 (Applied Biosystems) и программное обеспечение GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems).

Критерии интерпретации результатов

Результат фрагментного анализа был виден как набор пиков в области амплификации Tγ — 90 — 240 п.н., Tγγ — 100 — 260 п.н., Tβ — 200–250 п.н. Отрицательный (поликлональный) результат определяли при наличии множества пиков ПЦР-продукта. Результат считался положительным (моноклональным) при наличии одного или двух четких доминантных пиков ПЦР-продукта (в случае биаллельной реарранжировки). При этом пики ПЦР-продукта должны были преобладать и превышать поликлональный фон более чем в 3 раза. Если имелось более трех четких пиков, то результат оценивался как олигоклональный. При наличии одного или двух четких пиков, которые превышали поликлональный фон в 2–3 раза, результат оценивался как сомнительный моноклональный.

Из 46 больных ТКЛК моноклональность по генам TCRγ была обнаружена у 40 (87%). Из 20 этих же больных по генам TCRβ моноклональность лимфоцитов была обнаружена у 5 (25%). Более подробные данные о выявлении моноклональности лимфоцитов по генам γ- и β-цепей TCR с учетом клинических и иммунофенотипических особенностей лимфом кожи представлены в табл. 2.

Из 14 больных КБП моноклональность по генам TCRγ была обнаружена у 1 (7%), при мелкобляшечном парапсориазе (МБП) — ни в одном из 5 случаев.

Из 4 больных ВКЛК моноклональность лимфоцитов по генам тяжелой цепи IgH была выявлена у 3 (75%).

Из 2 пациентов с ТПЛК монокональность по генам TCRγ была обнаружена только у 1, а также из 6 больных с ВПЛК моноклональность по генам IgH не была обнаружена ни у одного пациента.

В 24 случаях ХВД в биоптате кожи была выявлена поликлональность по генам TCRγ.

При исследовании 10 биоптатов кожи и образцов периферической крови контрольной группы здоровых доноров была выявлена поликлональность по генам TCRγ.

Из 14 больных КБП моноклональность по генам TCRγ была обнаружена у 1 (7%), при мелкобляшечном парапсориазе (МБП) — ни в одном из 5 случаев. Из 4 больных ВКЛК моноклональность лимфоцитов по генам тяжелой цепи IgH была выявлена у 3 (75%). Из 2 пациентов с ТПЛК монокональность по генам TCRγ была обнаружена только у 1, а также из 6 больных с ВПЛК моноклональность по генам IgH не была обнаружена ни у одного пациента. В 24 случаях ХВД в биоптате кожи была выявлена поликлональность по генам TCRγ. При исследовании 10 биоптатов кожи и образцов периферической крови контрольной группы здоровых доноров была выявлена поликлональность по генам TCRγ.

Полученные данные свидетельствуют о корреляции между гистологически подтвержденными диагнозами ТКЛК и ВКЛК и выявлением моноклональности лимфоцитов по генам γ- и β-цепей TCR, а также по генам тяжелых цепей Ig соответственно, что дает основание использовать данные молекулярно-генетические методы с помощью ПЦР в ранней диагностике ЗЛК.

Кроме того, были подтверждены данные зарубежных исследователей о том, что моноклональность при ТКЛК развивается по мере нарастания инфильтративных изменений в очаге поражения. Обнаружение клона лимфоцитов в образце крови, идентичном биоптату кожи, свидетельствует о рециркуляции его из очага пораженной кожи в периферическую кровь.

Литература

1. Assaf C., Hummel M., Dippel E. et al. High detection rate of T-cell receptor beta chain rearrangements
in T-cell lymphoproliferations by family specific polymerase chain reaction in combination with the GeneScan technique and DNAsequencing. Blood 2000; 96(2): 640—646.

2. Simon M., Kind P., Kaudewitz P. et al. Automated High-Resolution Polymerase Chain Reaction Fragment Analysis. Am J Pathol 1998; 152: 29—33.

3. Holm N., Flaig M. J., Yazdi A.S. et al. The value of molecular analysis by PCR in the diagnosis of cutaneous lymphocytic infiltrates. J Cutan Pathol 2002; 29: 447—452.

4. Furmanczyk P.S., Wolgamot G.M., Kussick S.J. et al. Diagnosis of mycosis fungoides with different algorithmic approaches. J Cutan Pathol 2010; 37: 8—14.

5. Никитин Е.А., Сидорова Ю.В., Рыжикова Н.В. и др. Определение Т-клеточной клональности по гамма-цепи Т-клеточного рецептора: окончательные данные. Терапевтический архив 2006; 7: 52—57.

6. Muche J.M., Lukowsky A., Ahnhudt C. et al. Peripheral blood T cell clonality in mycosis fungoides -an independent prognostic marker? J Invest Dermatol 2001; 116 (3): 484—485.

7. Selkuvic K.L., Cikota B., Stojadinovic O., et al. TCRγ gene rearrangement analysis in skin and blood of mycosis fungoides patients. Acta Dermatovenerologica Alpina, Pannonica et Adriatica 2007; 16 (4): 149—155.

8. Cotta A.C., Cintra M.L., Macedo de Souza E., Magna L.A., Vassallo J. Reassessment of diagnostic criteria in cutaneous lymphocytic infiltrates. Sao Paulo Medical Journal 2004; 122 (4): 161—165.

9. Delfau-Larue M.H., Laroche L., Wechsler J. et al. Diagnostic value of dominant T-cell clones in peripheral blood in 363 patients presenting consecutively with a clinical suspicion of cutaneous lymphoma. Blood 2000; 96 (9): 2987—2992.

10. Dippel E., Assaf C., Hummel M., et al. Clonal Tcell receptor gamma-chain gene rearrangement by PCR-based GeneScan analysis in advanced cutaneous T-cell lymphoma: a critical evaluation. J Pathol 1999; 188: 146.

11. Klemke C.D., Dippel E., Dembinski A. et al. Clonal T cell receptor gamma-chain gene rearrangement by PCR-based GeneScan analysis in the skin and blood of patients with parapsoriasis and early-stage mycosis fungoides. J
Pathol 2002; 197 (3): 348—354.

12. Callan M.F., Steven N., Krausa P. et al. Large clonal expansions of CD8+ T cells in acute infectious mononucleosis. Natural Medicine 1996; 2(8): 906—911.

13. Lee S.C., Berg K.D., Racke F.K. et al. Pseudo-Spikes Are Common in Histologically Benign Lymphoid Tissues. J Mol Diagn 2000; 2 (3): 145—152.

14. Botella-Estrada R., Sanmartin O., Oliver V. et al. Erythroderma. A clinicopathological study of 56 cases. Archives of Dermatology 1994; 130: 1503.

8. Cotta A.C., Cintra M.L., Macedo de Souza E., Magna L.A., Vassallo J. Reassessment of diagnostic criteria in cutaneous lymphocytic infiltrates. Sao Paulo Medical Journal 2004; 122 (4): 161—165.

9. Delfau-Larue M.H., Laroche L., Wechsler J. et al. Diagnostic value of dominant T-cell clones in peripheral blood in 363 patients presenting consecutively with a clinical suspicion of cutaneous lymphoma. Blood 2000; 96 (9): 2987—2992.

10. Dippel E., Assaf C., Hummel M., et al. Clonal Tcell receptor gamma-chain gene rearrangement by PCR-based GeneScan analysis in advanced cutaneous T-cell lymphoma: a critical evaluation. J Pathol 1999; 188: 146.

11. Klemke C.D., Dippel E., Dembinski A. et al. Clonal T cell receptor gamma-chain gene rearrangement by PCR-based GeneScan analysis in the skin and blood of patients with parapsoriasis and early-stage mycosis fungoides. J
Pathol 2002; 197 (3): 348—354.

12. Callan M.F., Steven N., Krausa P. et al. Large clonal expansions of CD8+ T cells in acute infectious mononucleosis. Natural Medicine 1996; 2(8): 906—911.

13. Lee S.C., Berg K.D., Racke F.K. et al. Pseudo-Spikes Are Common in Histologically Benign Lymphoid Tissues. J Mol Diagn 2000; 2 (3): 145—152.

14. Botella-Estrada R., Sanmartin O., Oliver V. et al. Erythroderma. A clinicopathological study of 56 cases. Archives of Dermatology 1994; 130: 1503.

15. Cherny S., Mraz S., Su L., Harvell J., Kohler S. Heteroduplex analysis of T-cell receptor g gene rearrangement as an adjuvant diagnostic tool in skin biopsies for erythroderma. J Cutan Pathol 2001; 28: 351—355.

16. Beylot-Barry M., Sibaud V., Thiebaut R., et al. Evidence that an identical T cell clone in skin and peripheral blood lymphocytes is an independent prognostic factor in primary cutaneous T cell lymphomas. J Invest Dermatol 2001; 117 (4): 920—926.

17. Willemze R., Jaffe E.S., Burg G., Cerroni L., et al. WHO-EORTC classification for cutaneous lymphomas. Blood 2005; 105: 3768—3785.

18. Dongen J.J., Langerak A.W., Bruggemann M. et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations:
report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia 2003; 17: 2257—2317.

19. Greiner T.C., Raffeld M., Lutz C. et al. Analysis of T-cell receptor-gamma gene rearrangements by denaturing gradient gel electrophoresis of GC-clamped polymerase chain reaction products: correlation with tumor-specific sequences. Am J Pathol 1995; 146: 46—55.